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May 08, 2023

GSDMB細孔形成の構造基盤とIpaH7.8によるその標的化

Natura Volume 616, pagine

Nature volume 616、pages 590–597 (2023)この記事を引用

7971 アクセス

3 引用

99 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ガスダーミン (GSDM) は、ピロトーシスによる宿主防御において重要な役割を果たす孔形成タンパク質です 1,2。 GSDM の中でも、GSDMB は、その独特の脂質結合プロファイルと、そのパイロトーシスの可能性についてのコンセンサスが不足しているため、独特です 3,4,5,6,7。 最近、GSDMB は孔形成活性を通じて直接的な殺菌活性を示すことが示されました 4。 細胞内のヒトに適応した腸内病原体であるシゲラは、GSDMB4 のユビキチン化依存性プロテアソーム分解を引き起こす毒性エフェクターである IpaH7.8 を分泌することで、この GSDMB を介した宿主防御を回避します。 今回我々は、赤癬菌IpaH7.8と複合体を形成したヒトGSDMBおよびGSDMB細孔の極低温電子顕微鏡構造を報告する。 GSDMB-IpaH7.8 複合体の構造は、GSDMB 内の 3 つの負に荷電した残基のモチーフが、IpaH7.8 によって認識される構造決定基であることを特定します。 マウスではなくヒトの GSDMD にはこの保存されたモチーフが含まれており、これが IpaH7.8 の種特異性を説明しています。 GSDMB の細孔構造は、GSDMB の細孔形成の調節因子として、GSDMB 内の選択的スプライシングによって調節されるドメイン間リンカーを示しています。 正規のドメイン間リンカーを持つ GSDMB アイソフォームは通常のパイロトーシス活性を示しますが、他のアイソフォームはパイロトーシス活性が減弱しているか、またはまったく示しません。 全体として、この研究は、Shigella IpaH7.8 の GSDM の認識と標的化の分子機構に光を当て、そのパイロトーシス活性に重要な GSDMB の構造決定因子を示しています。

ガスダーミン (GSDM) タンパク質は、N 末端細孔形成ドメイン (GSDM-N)、C 末端自己抑制ドメイン (GSDM-C)、およびドメイン間リンカーで構成されています7、8、9、10、11、12、13、14 、15． ヒト GSDMB には、ドメイン間リンカーが異なる複数のスプライシング アイソフォーム (アイソフォーム 1 ～ 6、Q8TAX9、UniProt) があります。 アイソフォーム 1、4、および 6 には「標準的な」ドメイン間リンカーが含まれていますが、アイソフォーム 2 および 3 には短縮型リンカーが含まれており、アイソフォーム 5 には C 末端ドメインのみが含まれています 16。 GSDMB がピロトーシスを誘発するかどうかは依然として議論の余地があるが、最近の研究では、GSDMB が細菌膜を優先的に標的にし、感染中に微生物の増殖と拡散を直接制限することが示された 4,13。 しかし、このプロセスは、急性胃腸炎を引き起こす感染性の高いグラム陰性細菌である赤癬菌によって、その分泌されたエフェクタータンパク質である IpaH7.8 を介して阻止されます (参考文献 4)。 驚くべきことに、IpaH7.8 は GSDMB に加えて GSDMD にも結合します。 しかし、IpaH7.8 はヒトの GSDMD18 のみをユビキチン化し、マウスの GSDMD18 はユビキチン化しない。これは、ヒトおよび非ヒト霊長類が赤癬菌の自然保有者であるのに対し、マウスはそうではないという事実と関連している可能性がある19。 なぜ GSDMB がパイロトーシスの誘導において他の GSDM とは異なって機能するのか、また GSDMB とヒト GSDMD がどのようにしてShigella IpaH7.8 によって特異的に認識されるのかについての分子機構は不明である。

GSDMBがShigella IpaH7.8によってどのように認識されるかを理解するために、我々は、Shigella flexneri IpaH7.8と複合体を形成したヒトGSDMB（アイソフォーム1、Q8TAX9-1）の極低温電子顕微鏡（cryo-EM）構造を全体の分解能3.8Åで決定した。 (拡張データ図 1 および拡張データ表 1)。 この構造は、GSDMB-Nに結合するIpaH7.8-LRRドメインとの1:1複合体を示しています（図1a、b）。 IpaH7.8-LRR は、2 つの N 末端 α ヘリックス (α1 および α2) と C 末端 α4 ヘリックスでキャップされた 9 つの LRR モチーフを含むわずかに湾曲したソレノイド構造を形成し、β 鎖を直接増強する平行な β10 鎖も備えています。 LRRのシート（図1c）。 IpaH7.8-LRRの全体的なアーキテクチャは、以前に報告されたIpaH1.4およびIpaH3のLRRドメインの構造と非常に類似しています（参考文献20、21）（図1d）。 IpaH7.8 の C 末端 NEL ドメインの密度はマップ上では見えませんが、これはおそらく複合体の柔軟性が原因で、GSDMB4 内の複数のリジンのユビキチン化が可能になっているためです (拡張データ図 1c)。

a、IpaH7.8 および GSDMB のドメイン スキーム。 ドメイン境界にはラベルが付けられます。 b、GSDMB-IpaH7.8 複合体の全体構造を 2 つの図で示します。 IpaH7.8 の LRR ドメインと GSDMB-N および -C 末端ドメインは、a のように色付けされています。 c、IpaH7.8-LRRドメインの構造を示すリボン図。 d, IpaH1.4 (黄色; PDB: 7V8H) および IpaH3 (シアン; PDB: 3CVR) LRR ドメインへの IpaH7.8-LRR (サーモン) の重ね合わせ。 e、GSDMBの全体構造（左）、およびGSDMBとマウスGSDMA3（PDB：5B5R）の構造の重ね合わせ（右）。 マウス GSDMA3 の β4 鎖は、GSDMB 構造では観察されません。 GSDMA3 N 末端ドメインと C 末端ドメインは、それぞれ茶色と灰色に着色されました。 f、GSDMB-N末端α4ヘリックスとGSDMB-Cの間の界面の拡大図。 GSDMB-C は静電ポテンシャルとして示され、GSDMB-N 末端の α4 ヘリックスは漫画として示され、相互作用に関与する疎水性残基は棒として示されます。 NT、N末端ドメイン。 CT、C末端ドメイン。

GSDMBは、GSDMA3およびGSMDD7、8の自己抑制構造と非常によく似た自己抑制構造をとります（図1e）。 予測されたβ4鎖（GSDMA3構造を参照）は密度では観察されませんでしたが、α4ヘリックスはGSDMB-Nから突き出てGSDMB-Cに接触しました（図1e）。 GSDMB-Cの局所解像度はGSDMB-N/IpaH7.8-LRRコアよりも相対的に低く、GSDMBのN末端ドメインとC末端ドメイン間のダイナミクスを示しています（拡張データ図1c）。 解像度は低いにもかかわらず、GSDMB-C の主鎖を追跡することができました。GSDMB-C は、以前に決定された結晶構造と同様の 8 つのヘリックスからなる束を採用しています 6 (図 1e および拡張データ図 2a)。 GSDMB は、(1) 切断することなくホスファチジルイノシトールリン酸およびスルファチドに結合する能力、および (2) GSDMB-C にはドメイン間相互作用に必須のサブドメインが欠如しているため、全長構造における自己阻害が減少していると考えられていました6。 22 (拡張データ図 2b)。 私たちの構造では、GSDMB-Cは、GSDMA3のサブドメインによって寄与されたヘリックスα9とα11ではなく、ヘリックスα9、α10、α12によって形成された巨大な疎水性溝を通して、突き出たGSDMB-N α4ヘリックスを捕捉し、その結果、GSDMA3のサブドメインによってさらに大きなドメイン間界面が形成されます。 GSDMB（GSDMBの総インターフェース面積は3,020Å2、GSDMA3では2,745Å2）（図1e、f）。 我々は、全長 GSDMB はリン脂質結合に切断以外の異なる機構を使用しているのではないかと推測しています。

GSDMB-IpaH7.8複合体では、IpaH7.8-LRRの9つのLRRモチーフのうち6つがGSDMB-Nと相互作用し、その結果、2つのタンパク質間に約1,826Å2の総埋没表面積が生じ、主要な相互作用領域は2つに分割されます。パッチIとII。 IpaH7.8 の LRR7-LRR9 は、GSDMB-N 内のいくつかの負に荷電した残基を含む短いループ (α1-β1' ループ、残基 15-21) と接触して最初のパッチ (I) を形成しますが、IpaH7.8-LRR4-6 は相互作用します。 GSDMBの最初の拡張ドメイン（ED1）9,23のβ3鎖が2番目のパッチ（II）を形成しています（図2a）。

a. GSDMB と IpaH7.8 の間の 2 つのインターフェイスが破線のボックスで強調表示されています。 b、インターフェースパッチIの詳細な相互作用。このインターフェースに参加する残基はボールとスティックとして示されています。 水素結合は灰色の点線で示されます。 c、GSDMB（WTおよび変異体）およびIpaH7.8を使用したin vitroユビキチン化反応のクマシーブルー染色SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）。 3 つの独立した実験を代表する結果。 d、インターフェイスパッチ II の詳細なインタラクション。 このインターフェースに参加している残基は、ボールとスティックとして示されています。 水素結合は灰色の点線で示されます。 e、IpaH7.8（WTまたは変異体）によるGSDMBのin vitroユビキチン化のクマシーブルー染色SDS-PAGE。 3 つの独立した実験を代表する結果。 f、FLAGタグ付きGSDMBおよびHA-IpaH7.8（WTまたは変異体）を同時トランスフェクトしたHEK293T細胞におけるGSDMBユビキチン化の免疫ブロット。 WCL、全細胞溶解物。 3 つの独立した実験を代表する結果。 g、IpaH7.8によるGSDMBまたはヒトGSMDD（WTおよび変異体）のin vitroユビキチン化のクーマシーブルー染色SDS-PAGE。 3 つの独立した実験を代表する結果。 h、IpaH7.8によるマウスGSMDD（WTおよび変異体）のin vitroユビキチン化のクーマシーブルー染色SDS-PAGE。 D17HG および D17AG は、マウス GSDMD の非保存配列 (S17GSR20) を、それぞれ対応するヒト GSDMD および GSDMB 配列で置き換えます。 GSDMB とヒトおよびマウスの GSDMD 間の α1 – β1 ' モチーフ (下線) のアミノ酸配列アラインメントを SDS – PAGE 上に示します。 3 つの GSDM 間で交換されたシーケンスは、赤いボックスで強調表示されます。 3 つの独立した実験を代表する結果。 i、j、IpaH7.8およびGSDMB（WTおよび変異体）を使用したin vitroユビキチン化反応のクーマシーブルー染色SDS-PAGE。 GSDMB の β3 鎖は、i に示すように変異するか、j の対応するヒト (hβ3) およびマウス (mβ3) GSDMD 配列によって交換されます。 jの対照は、変異体IpaH7.8C357によるWT GSDMBのユビキチン化を示した。 3 つの独立した実験を代表する結果。

界面パッチ I は主に極性相互作用によって媒介されます。 特に、IpaH7.8 の LRR7 の Q185 と R186、LRR8 の Y207 と H209、および LRR9 の R228、N230 および S232 の側鎖は、GSDMB の E15、D17、A18、および D21 と 10 個の水素結合を形成します。 一方、IpaH7.8の正に帯電したR186およびR228の側鎖は、GSDMBのそれぞれE15およびD21の負に帯電した側鎖と余分な塩橋を形成します（図2b）。 興味深いことに、GSDMBのE15およびD17の側鎖は、IpaH7.8の周囲の残基とともにR186およびH209によって形成される2つの小さな塩基性ポケットに挿入されます（拡張データ図3a）。 2 つのポケットは約 10 Å 離れており、IpaH7.8 がこの正確な距離にある 2 つの酸性残基を含む特定のモチーフを認識する潜在的なメカニズムを示唆しています。 実際、GSDMBのE15またはD17の逆荷電または非荷電残基への単一変異は、in vitroでのIpaH7.8によるGSDMBのユビキチン化を有意または部分的に減少させた（図2c）。

相互作用パッチ II は、水素結合と疎水性相互作用およびファンデルワールス相互作用によって媒介されます。 IpaH7.8-LRR4 の R125 の側鎖は、GSDMB の E83 の主鎖カルボニル基および Q85 のカルボキシレート酸素 OE1 と 2 つの水素結合を形成します。 並行して、LRR6 の Y165 の側鎖は、GSDMB の L87 の主鎖アミノ基および Q85 の主鎖カルボニル基と 2 つの水素結合を形成し、LRR6 の Y166 は、GSDMB の L87 の主鎖カルボニル基と水素結合を形成します。 さらに、IpaH7.8のLRR5の残基F143、E145およびN146、ならびにIpaH7.8のLRR6のF161およびH163は、広範な疎水性相互作用およびファンデルワールス相互作用を通じてGSDMB β3鎖と接触します（図2d）。

構造ベースの配列アラインメントにより、IpaH7.8 の両方のパッチの主要な残基が他の IpaH ファミリータンパク質の同等の位置で分岐していることが示され (拡張データ図 3b)、IpaH7.8 は GSDMB4 を特異的に標的とする IpaH ファミリーのユニークなメンバーとなっています。 、18． IpaH7.8 の主要な残基の変異（インターフェイス パッチ I の R186E、H209G、R228D、R186E/R228D、インターフェイス パッチ II の F143S、F161G/I181G、Y165A/Y166A、Y165E/Y166E など）はすべて、大部分または完全に、 IpaH7.8のGSDMBをユビキチン化する能力（図2e）。 R186E / R228D および Y165E / Y166E の変異も、細胞内の IpaH7.8 媒介ユビキチン化と GSDMB の分解を大幅に弱めます（図 2f、拡張データ図 3c、および補足図 1 および 2）。

シゲラ IpaH7.8 はヒトとマウスの両方の GSDMD に結合することが以前に示されています。 ただし、ユビキチン化するのはヒト GSDMD18 のみです。 等温滴定熱量測定 (ITC) を使用して、IpaH7.8 と GSDMB/D の間の相互作用を特徴付けました。 IpaH7.8は、ヒトGSDMD（解離定数（Kd）20.4±1.8μM）に対して、GSDMB（Kd = 0.44±0.03μM）よりも46倍低い親和性を示しました（拡張データ図4a、b）。 驚くべきことに、IpaH7.8とマウスGSDMDとの間に相互作用は検出されなかった(拡張データ図4c)。 それらの親和性と一致して、分析用ゲル濾過クロマトグラフィーは、IpaH7.8がGSDMBと効率的に共移動し、ヒトGSMDDと部分的に移動するのに対し、マウスGSDMDとはほとんど共移動しないことを示しました（拡張データ図4d–f）。 したがって、我々は、Shigella IpaH7.8 はヒトの GSDMD には結合するが、マウスの GSDMD には結合しないと結論付けました。

N 末端近くのフラグメント (残基 16 ～ 21) をヒト配列に置換すると、細胞内での IpaH7.8 媒介マウス GSDMD の分解がうまく回復されました 18。 我々の複雑な構造では、このフラグメントはGSDMBのα1-β1'ループに対応し、3つの負に荷電した残基のモチーフ（α1-β1'モチーフ）がIpaH7.8と広範囲に相互作用します（図2b）。 構造ベースの配列アラインメントにより、このモチーフはヒトGSDMDでは保存されているが、マウスGSDMDでは保存されていないことが示されました（GSDMBではE15MD17AGGD21、ヒトGSDMDではE15LD17HGGD21、マウスGSDMDではE15VS17GSR20GD22）（拡張データ図2b）。 マウス GSDMD には保存された E15 が含まれていますが、2 番目の酸性残基がセリン (mS17) に置換されています。 マウス GSDMD も保存された 3 番目の酸性残基 (mD22) を含みますが、20 位 (mR20) に独特のアルギニン挿入があります (拡張データ図 2b)。 D17をセリンで置換すると、IpaH7.8ではY207およびN230との相互作用が破壊される可能性がありますが、mR20の挿入により、おそらく次のアスパラギン酸（mD22）がIpaH7.8のR228との相互作用から遠ざけられ（図2b）、相互作用がブロックされます。マウス GSDMD および IpaH7.8。 したがって、GSDMBおよびヒトGSMDMDにおける20位にアルギニンが挿入された単一変異（R20Ins）とD17S/R20Insの二重変異は、IpaH7.8との相互作用をブロックし、その後IpaH7.8媒介ユビキチン化を損なった（図2gおよび拡張図）。データ図4g、h）。 一方、マウスGSDMDの非保存α1-β1'モチーフを対応するGSDMBまたはヒトGSMDD残基で置換すると、IpaH7.8によるマウスGSMDDのユビキチン化が回復した（図2h）。

同様の構造的特徴にもかかわらず、GSDMのβ3鎖のアミノ酸配列は非常に多様です（拡張データ図4i）。 我々は、GSDM の β3 鎖が IpaH7.8 による認識のための別の構造決定因子として機能するかどうか疑問に思いました。 しかし、GSDMB の β3 鎖は主にそのバックボーンを介して IpaH7.8 と相互作用し、配列に依存しない相互作用モードを示しています。 私たちの仮説と一致して、GSMDBのβ3鎖の変異はユビキチン化に影響を与えませんでした（図2i）。 さらに、GSDMB、ヒトGSMDD、およびレスキュー変異（D17HG）を有するマウスGSDMD変異体の間でβ3鎖を交換しても、それらのユビキチン化には影響しませんでした（図2jおよび拡張データ図4j）。 したがって、α1-β1'ループ内の3つの負に荷電した残基モチーフがGSDMの構造決定因子であると結論付けます。

β3 鎖は GSDM 細孔形成の必須要素である 8,9,23 ため、次にこの鎖への IpaH7.8 の結合が GSDMB 細孔形成を直接阻害するかどうかを試験しました。 予想通り、グランザイムA（GZMA）で切断されたGSDMBは、カルジオリピン（CL）4を含むリポソームから6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）色素の急速な漏出を引き起こし（図3a）、GSDMB細孔の形成を示しました。 この GSDMB 誘発リポソーム漏出は、IpaH7.8 の存在下で大幅に阻害されましたが、GSDMB を、もはや相互作用しない 2 つの IpaH7.8 変異体である IpaH7.8Y165E/Y166E または IpaH7.8R228D/R186E とインキュベートした場合には、有意な阻害は観察されませんでした。 GSDMB (図 3a および拡張データ図 5a)。 GSDMB4,18にまだ結合する触媒的に不活性な変異体であるIpaH7.8C357Aも、GSDMB誘発性のリポソーム漏出を減弱させた（図3a）。 濃度滴定により、IpaH7.8が用量依存的にGSDMBの活性を阻害し、最大阻害濃度の半分（IC50）が1.46±0.11μMであることがさらに実証されました（図3bおよび拡張データ図5b）。 IpaH7.8はGSDMBの切断には影響を及ぼさなかったが、リポソームへのGSDMB-Nの結合を直接阻害した(拡張データ図5c)。 興味深いことに、IpaH7.8は、カスパーゼ-11で切断されたヒトGSDMDによって引き起こされるリポソーム漏出を阻害しませんでした（拡張データ図5d）。 ヒト GSDMD-N とリポソームの結合は、非常に高濃度の IpaH7.8 によってのみ阻害されました (拡張データ図 5e)。

ａ、ＩｐａＨ７．８（ＷＴまたは示された変異体）とインキュベートした場合のＣＬ含有リポソーム（ＣＬリポソーム）の漏出を誘導するＧＳＤＭＢの能力。 b、リポソーム漏出アッセイにおけるGSDMBの細孔形成活性の阻害におけるIpaH7.8の用量反応曲線。 蛍光増加の初期勾配 (RU min-1) を IpaH7.8 濃度の対数に対してプロットして、IpaH7.8 の IC50 を決定しました。 RU、蛍光の相対単位。 a、b、各ドットは、3 つの技術的反復の平均 ± SD を表します。 c、IpaH7.8によるGSDMB媒介細菌死滅の阻害。 WT: 野生型。 YY: Y165E/Y166R; RR: R186E/R228D。 エラーバー、3 つの独立した実験の平均値 ± SD。 *P < 0.05、**P < 0.005、***P < 0.0005。 一元配置分散分析 (ANOVA) に続いて Tukey の事後検定を行い、バッファーコントロールと比較します。 d、ユビキチン化および非ユビキチン化GSDMBとCL-リポソームとの会合を示すリポソーム沈降アッセイ。 上清とペレット（リポソーム）をクーマシーブルーで染色した SDS-PAGE で分析しました。 FL、フルレングス。 e、CL-リポソームからの蛍光放出の誘導におけるGSDMBの細孔形成活性の阻害に対するユビキチン化の効果。 各ドットは、3 回の技術的反復の平均 ± SD を表します。 f、GSDMBとヒトGSMDDの両方における膜貫通領域のリジン、脂質結合界面、およびオリゴマー化界面が示されています。 g、リジンを持たない（allKR）または単一のリジン（示したとおり）を含むGSDMB変異体のin vitroユビキチン化のクーマシーブルー染色SDS-PAGE。 3 つの独立した実験を代表する結果。 h、CL-リポソームを使用した、gからのユビキチン化GSDMB変異体の細孔形成活性のモニタリング。 蛍光測定は30分の時点で行われた。 結果は、3 回の技術的反復の平均 ± SD を表します。 ｉ、ユビキチン化ＧＳＤＭＢ３Ｒ変異体の細孔形成活性のモニタリング。 GSDMB3R: GSDMB では K177/K190/K192 がアルギニンに変異します。 各ドットは、3 回の技術的反復の平均 ± SD を表します。

GSDMB は細菌膜上の特定のリン脂質の認識によって直接的な殺菌活性を有するため 4、次に、IpaH7.8 が GSDMB の抗菌活性を直接阻害するかどうかを調べました。 GZMA で切断された GSDMB に曝露すると、大腸菌 DH5α の約 50% が死滅しましたが、細菌の生存率は野生型 (WT) IpaH7.8 の添加によって大幅に回復しましたが、変異体 IpaH7.8Y165E/Y166E および IpaH7 では回復しませんでした。 .8R186E/R228D。 全長GSDMBまたはIpaH7.8単独では細菌の増殖に影響を与えませんでした（図3c）。 これらの観察は、IpaH7.8 が GSDMB の直接の阻害剤であることを示唆しています。

IpaH7.8媒介ユビキチン化自体は、GSMDDが膜と結合するのを防ぐには不十分でした18（拡張データ図5f）。 IpaH7.8 による GSDMD 媒介ピロトーシスの阻害は、その後のプロテアソーム分解に依存します 18。 この報告と一致して、我々のリポソーム漏出アッセイは、ユビキチン化されていないものと同等のユビキチン化ヒト GSDMD の活性を示しました（拡張データ図 5g）。 しかし、予想外なことに、ユビキチン化GSDMBは、リポソームと結合する能力と、リポソーム漏出を誘発する細孔形成活性をほぼ完全に失いました（図3d、e）。

次に、GSDMB-N のどのリジンがユビキチン化を介した細孔形成活性の阻害に関与しているのか疑問に思いました。 GSDMB には 31 個のリジンが含まれており、そのうち 16 個が細孔形成ドメインに含まれていますが、ヒト GSDMD には 15 個のリジンしかなく、そのうち 12 個が細孔形成ドメインにあります。 これらのリジンのうち、K14 は GSDMB に特有で、GSDM 細孔の集合に関与する領域であるヘリックス α1 の C 末端に局在し 9,23、K43 は脂質結合界面の近くに位置します。 K14 および K43 のユビキチン化は、GSDMB-N オリゴマー化と脂質結合に影響を与える可能性があります。 K102、K177、K190、および K192 は膜貫通領域に位置し、GSDMB と GSDMD の両方で保存されています。 ただし、GSDMDよりもGSDMBの方が膜内にさらに埋め込まれています（図3fおよび拡張データ図6）。 これらの残基のユビキチン化は、GSDMB の膜挿入に影響を与える可能性があります。 これらの可能性を実験的に調べるために、すべてのリジンがアルギニンに変異した GSDMB コンストラクト (変異体 allR)、および 1 つのリジン (K14、K102、または K177) または 2 つのリジン (K190/K192) のいずれかを有するコンストラクトを生成しました。 インビトロユビキチン化アッセイは、これらすべてのGSDMB構築物がIpaH7.8のE3リガーゼ活性の活性化を引き起こすことを示し、これらの変異体の正しいフォールディングとIpaH7.8に結合するそれらの能力を示しました（参考文献24）（図3g、ポリUb） ）。 ただし、GSDMBK177およびGSDMBK190/K192のみがIpaH7.8によってユビキチン化されました（図3g、入力と比較したGSDMB-FLの消失）。 対応して、ユビキチン化GSDMBK177およびGSDMBK190/K192変異体は、リポソーム漏出の誘導における活性の大幅な減弱を示した(図3h)。 次に、WT GSDMB (変異体 3R) の 3 つのリジンすべて (K177、K190、および K192) を変異させ、ユビキチン化および細孔形成活性に対する影響をテストしました。 GSDMB3R変異体は依然としてIpaH7.8によるユビキチン化を受けており、GSDMB4,18には他のユビキチン化部位が存在することが示されている（拡張データ図5h）。 しかし、ユビキチン化GSDMB3Rは、ユビキチン化されていないものと同等の細孔形成活性を持っていました（図3i）。 総合すると、本発明者らは、IpaH7.8によるGSMDBのK177、K190およびK192におけるユビキチン化は、プロテアソーム分解を必要とせずに細孔形成活性を阻害するのに十分であると結論付ける。

その直接的な殺菌活性にもかかわらず 4、GSDMB がパイロトーシスを誘発するかどうかはまだ決定的ではありません。 我々は、5 つのヒト GSDMB アイソフォーム (アイソフォーム 1 ～ 4 および 6) のドメイン間リンカーの長さと配列の両方が異なることに気づきました 25 (図 4a および拡張データ図 6)。 リンカーはGSDMBとIpaH7.8の相互作用には関与せず（図1e）、5つのGSDMBアイソフォームすべてがユビキチン化と阻害のためにIpaH7.8によって同様に標的とされました（拡張データ図7a、b）。 リンカーも GZMA 切断に影響を与えません (拡張データ図 7c)。 むしろ、リンカーは GSDMB 細孔形成活性の調節に役割を果たしている可能性があります 3。 これまでの研究では、ドメイン間リンカーに標準配列を含む GSDMB アイソフォーム 4 および 6 が、インビトロと細胞の両方で強力な膜透過活性を示したことが示されています 5,7。一方、標準配列を欠くアイソフォーム 2 はパイロプトーシス活性を持っていません 3。 驚くべきことに、アイソフォーム 1 もドメイン間リンカーに標準配列を含み、パイロトーシス性細胞死を誘導しません。 むしろ、細菌の膜を標的にして細菌を殺します4。 一貫して、アイソフォーム 4 または 6 の N 末端ドメインでトランスフェクトされた細胞は、全長 GSDMB でトランスフェクトされた細胞と比較して、顕著なパイロトーシス性細胞死を示すが、アイソフォーム 1、2、または 3 の N 末端ドメインでは示されないことがわかりました（図 4b および拡張データ図 7d)。 興味深いことに、アイソフォーム 4 を介したパイロトーシス細胞死は、Shigella IpaH7.8 と共発現させた場合に有意に阻害されました。 この阻害はIpaH7.8のE3リガーゼ活性とは無関係であり（拡張データ図7e、f）、IpaH7.8の結合がGSDMBの細孔形成活性を直接阻害したことがさらに確認された。 in vitro で哺乳動物の原形質膜に対する GSDMB アイソフォームの細孔形成活性をさらに調べるために、10% ホスファチジルセリン (PS) を含むリポソームを使用してリポソーム漏出アッセイを実行しました。 我々の結果は、アイソフォーム4および6がPS-リポソームに対して強い透過活性を示したが、アイソフォーム2および3は膜透過活性を示さなかったことを示した（図4c）。 肝臓極性脂質抽出物を含むリポソームについても同様の結果が観察された（図４ｄ）。 興味深いことに、アイソフォーム 1 は、アイソフォーム 4 および 6 と比較して、細孔形成活性の 20 ～ 40% のみを示しました（図 4c、d）。 GSDMB アイソフォーム 1 の弱い透過活性は、パイロトーシスを誘導するために ESCRT-III26 などの細胞機構による膜修復努力を克服するにはおそらく不十分ですが、細菌に対するアイソフォーム 1 の毒性はあるものの、膜修復機構を欠く細菌を殺すには十分です。はアイソフォーム 4 および 6 よりわずかに弱かった (拡張データ図 7g)。 これらのデータは、ドメイン間リンカーが異なる GSDMB アイソフォームが異なる細孔形成活性を示すことを示しています。

a、GSDMB アイソフォーム 1 ～ 4 および 6 のスキーム。ドメイン間リンカーのアミノ酸 (aa) 配列が示されています。 正準配列はオレンジ色で下線が引かれており、脂質結合を媒介する 3 つの正に荷電した残基は青色で強調表示され、GZMA 切断部位は標識されています。 アイソフォーム 5 は、N 末端細孔形成ドメインを含まないため、示されていません。 b、一時的にトランスフェクトされたHEK293T細胞におけるヘキスト/ヨウ化プロピジウム(PI)二重染色アッセイによって測定されたGSDMBアイソフォームの細胞毒性。 エラーバー、3 つの独立した実験の平均値 ± SD。 一元配置分散分析とその後の Tukey の事後検定。 ****P < 0.00001。 c、d、10％PSを含むリポソーム（c）および生きた極性脂質抽出物を含むリポソーム（d）を使用した、精製GSDMBアイソフォームの細孔形成活性のモニタリング。 各ドットは、3 回の技術的反復の平均 ± SD を表します。

なぜ GSDMB アイソフォームが異なる細孔形成活性を示すのかという疑問に対処するために、我々は GSDMB 細孔のクライオ EM 構造を決定しようとしました。 GSDMB アイソフォーム 1、4、および 6 は同様のサイズと形状の細孔を形成しましたが、アイソフォーム 1 の細孔はアイソフォーム 4 および 6 よりも凝集が少なく、アイソフォーム 1 の細孔はクライオ EM グリッド上に均一に分布していることがわかりました (拡張データ図) .8a、b)。 そこで、GSDMB アイソフォーム 1 をクライオ EM 分析に供しました。 収集されたクライオ EM データセットの 3 次元 (3D) 分類により、GSDMB β バレル細孔の主要なクラス、プレ細孔を表す β バレルのないリングのクラス、および GSDMB プレ細孔 - 細孔遷移の中間状態を表すその他のクラスが得られました 9,23 (拡張データ図 8c および 9a、b)。 GSDMB細孔は24〜26倍対称であることがわかりました（図5a）。 24 分割対称細孔の 3D 精密化により、全体解像度 4.96 Å の最終マップが得られましたが、焦点精密化により球状領域の局所解像度が 4.48 Å に向上しました (拡張データ図 8c、d および拡張データ表 1)。 GSDMB/IpaH7.8 複合体中の GSDMB 構造を開始モデルとして使用して、GSDMB 細孔の原子モデルを構築します。

a、クライオ EM 密度マップに適合させた 24 サブユニット GSDMB アイソフォーム 1 細孔構造のリボン ダイアグラム。 TM、膜貫通。 b、クライオEMマップに適合した細孔構造におけるGSDMBサブユニットの構造。 c、GSDMBの3つの脂質結合部位（BS1〜3）が示されており、それぞれα1、ループβ1〜β2およびβ7〜β8に位置しています。 脂質結合に関与する残基は標識されています。 d – f、ヒトGSDMD（d）、GSDMBアイソフォーム1（e）、GSDMBアイソフォーム4および6（f）がどのように膜に固定されるかを示す図。 GSDM のドメイン間リンカーは、示されている色で強調表示されます。 ドメイン間リンカーで標識された正に荷電した残基は、余分な脂質結合部位 (BS4) を形成します。 GSDMB アイソフォーム 1 は、4 つのアミノ酸が挿入されているため、ドメイン間リンカーに正に帯電した残基を 1 つだけ保存します。 g、リポソーム漏出アッセイによるGSDMBアイソフォーム4（左）およびヒトGSDMD（hGSDMD、右）の細孔形成活性のモニタリング。 BS4: 3 つの塩基性残基 (GSDMB アイソフォーム 4 の R225/K227/K229 および hGSDMD の K235/K236/R238) のグルタミン酸への三重変異。 GSDMB アイソフォーム 4 と hGSDMD は、それぞれ GZMA と活性型カスパーゼ 11 によって切断されました。 各ドットは、3 回の技術的反復の平均 ± SD を表します。 ｈ、Ｈｏｅｃｈｓｔ／ＰＩ二重染色アッセイによってモニタリングした、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるパイロトーシス細胞死の誘導に対するＧＳＤＭＢアイソフォーム４のＢＳ４およびｈＧＳＤＭＤの効果。 NT、N末端ドメイン。 NTBS4、BS4 変異を含む N 末端ドメイン。 エラーバー、3 つの独立した実験の平均値 ± SD。 一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後検定、**P < 0.005、****P < 0.00005。

24 倍 GSDMB 細孔は、推定内径 150 Å、外径 250 Å、高さ 60 Å であり（図 5a）、27 倍 GSDMA3 細孔と非常によく似ていますが、31 倍 GSDMD 細孔よりもはるかに小さい9 、23。 GSDMA3 および GSDMD と同様に、各 GSDMB 細孔サブユニットは、球状ドメイン (「手のひら」) と、拡張ドメイン 1 および 2 (それぞれ ED1 および ED2) の残基から生成された 2 つの挿入された β ヘアピン (「指」) を含みます。全長自動抑制GSDMB（図5bおよび拡張データ図9c）。 GSDMB 細孔の分析により、以前に GSDMA3 と GSDMD の両方で観察された保存されたオリゴマー化界面が示されました 9,23。 GSDMB細孔オリゴマー化は、膜貫通領域に挿入されたβ鎖と細胞質ゾル球状ドメインの両方によって媒介されます（拡張データ図9d）。 膜貫通領域における相互作用は、サブユニット間の隣接するβ3およびβ8鎖に沿って走る残基によって寄与されます（拡張データ図9d）。 隣接する球状ドメインの相互作用には、隣接するサブユニットのα2およびβ11の周囲の領域と相互作用する1つのサブユニットのヘリックスα3からの残基がほとんど含まれています（拡張データ図9d）。 そして、1つのサブユニットのα1ヘリックスが、水素結合と疎水性相互作用を通じて次のサブユニットのα1ヘリックスと端から並んでいます（拡張データ図9d）。 これらの保存された相互作用は、集合化学量論のばらつきにもかかわらず、GSDM ファミリーにおける統一されたオリゴマー化機構を示唆しています。

これまでの研究では、N末端のα1ヘリックス（「親指」、結合部位1（BS1））、正に荷電した残基が両側にある疎水性先端を持つβ1-β2ループ（「手首」、結合部位2（BS2））が同定されている。 GSDM 球状ドメインと正に荷電した脂質結合部位 (結合部位 3 (BS3)) は、脂質結合の構造要素として膜に挿入された β7-β8 ヘアピン上に存在します 8,9,23。 予想通り、3 つの結合部位はすべて GSDMB に保存されています (図 5c)。 BS1 および BS2 には、α1 ヘリックスに R10 および K14 の塩基性残基が含まれ、酸性脂質頭部基と相互作用する β1-β2 ループに K43、R44、および R50 が含まれ、β1-β2 ループの疎水性先端挿入部に F46 および F47 の疎水性残基が含まれています。 BS3は膜アンカーとして脂質二重層に侵入しますが、BS3はβ7およびβ8のR174およびR195の塩基性残基によって媒介されます（図5c）。

次に、ドメイン間リンカーを調べました。 ヒト GSDMD 細孔では、ドメイン間リンカー全体 (V229-Q241) の密度が見えます (拡張データ図 9e)。 GSDMD のドメイン間リンカーの最初の数残基 (領域 1: V229 ～ F232) は、ポアのオリゴマー化に必要です 8 (拡張データ図 6 および 9e)。 GSDMBアイソフォーム1および4の対応する領域の変異（それぞれアイソフォーム1の「AGLD」およびアイソフォーム4の「NIHF」から「GGGG」）は、細孔形成活性を著しく損ないました（拡張データ図9g、h）。 GSDMB の領域 1 と同様の役割。 ドメイン間リンカー内の次の配列 (領域 2: ヒト GSDMD の P233 ～ Q241) は、以前は細孔形成に関与する構造要素とは考えられていませんでした 8、9、23。 驚くべきことに、比較的低い解像度にもかかわらず、GSDMB 細孔の領域 2 の密度も表示されます (拡張データ図 9f)。 我々は、領域 2 が細孔内の特定の相互作用によって安定化されている可能性があることを示唆しました。 ヒトGSMDDの領域2には、膜の方向を向いた正に帯電した側鎖を持つ3つの塩基性残基が含まれており、おそらく膜付着のための余分な脂質結合部位（BS4）を形成している（図5d）。 GSDMB の標準ドメイン間リンカーには、領域 2 に塩基性残基も含まれています (図 4a および拡張データ図 6)。 ただし、GSDMB アイソフォーム 1 細孔では、1 つの塩基性残基 (R229) だけが構造的に保存されています。 ドメイン間リンカーに4アミノ酸（222AGLD225）が挿入されているため、最初の位置（P1）の残基が負に帯電したD225に置き換えられます（図5e）。 この位置での酸性残基による置換は、おそらく酸性膜表面を反発することによって膜結合を弱め、その結果、GSDMB アイソフォーム 1 の細孔形成活性が弱まる。アイソフォームの構造に基づいて、ドメイン間リンカー全体をカバーする他の GSDMB アイソフォームの生成された原子モデル図１およびAlphaFold予測27の支援により、アイソフォーム4および6がヒトGSMDDに対して構造的に保存され、3つの基本残基R225、K227およびK229がすべて保存されていることを示します（図5f）。 対照的に、切断されたドメイン間リンカーを持つアイソフォーム 3 は、おそらくオリゴマー化界面を保存しますが、脂質結合のための基本的なクラスターを欠き、アイソフォーム 2 にはオリゴマー化と脂質結合のためのドメイン間リンカー全体が欠如しています。 ドメイン間リンカーの標準配列をコードするエクソン 6 を持たない GSDMB アイソフォームがパイロトーシスを誘発しないことを示した最近の研究は、我々のモデルを強く支持しています 3。

GSDMBアイソフォーム4のドメイン間リンカーにおけるR225E/K227E/K229Eの三重変異により、インビトロでリポソーム漏出を誘導し（図5g）、パイロプトーシス細胞死を媒介するその活性が著しく低下した（図5hおよび拡張データ図9i）。 GSDMB 細孔形成の媒介における BS4 の重要な役割が確認されました。 ヒトGSMDDの対応する残基を変異させた場合にも同様の結果が観察されました（図5g、hおよび拡張データ図9j）。 総合すると、我々は、ドメイン間リンカーが、細孔オリゴマー化の媒介と余分な脂質結合部位の提供によって、GSDMBアイソフォームのパイロプトーシス活性を調節する重要な構造要素であると結論付ける。

GSDMB-IpaH7.8複合体とGSDMB細孔の低温EM構造は、それぞれ細菌エフェクターによるGSDMB認識とGSDMBのパイロトーシス活性の基礎となる構造機構を示しています。

GSDMB-IpaH7.8複合体の構造から、GSDMBおよびヒトGSMDDのN末端α1-β1'ループにある3つの負に荷電した残基のモチーフが、Shigella IpaH7.8によって特異的に認識される構造決定基であることが特定された。 IpaH7.8 は、α1-β1' モチーフが保存されていないマウス GSDMD に結合しないため、赤癬菌がマウスに効率的に感染を確立することができなくなります。 以前、IpaH7.8 はヒト GSDMD18 よりもさらに強い親和性でマウス GSDMD に結合すると報告されましたが、これは我々の結果と一致しません。 この不一致は、使用された方法の違いに起因する可能性があります。 以前の研究で使用されたマイクロスケール熱泳動法では、疎水性蛍光色素によるタンパク質の標識が必要であり、これによりタンパク質の挙動が変化し、混乱を招く結果につながる可能性があります 28,29。 あるいは、ここで使用した ITC メソッドは、標識を必要とせずに、ネイティブな状態でタンパク質の結合親和性を確実に測定します 30。 これは、我々の突然変異誘発実験と最近の研究報告によっても裏付けられています31。

私たちの研究は、IpaH7.8 による GSDMB の非常に効率的な阻害を実証しています。IpaH7.8 の GSDMB への結合は、膜との会合を直接妨げます。 さらに、その後の IpaH7.8 による GSDMB のユビキチン化は、赤癬菌が宿主のユビキチン化システムをハイジャックする際に、GSDMB 活性をさらに阻害します。 この阻害は、GSDMB の 2 番目の膜貫通ヘアピンにある 3 つのリジンのユビキチン化によって媒介されます。 ユビキチン化はおそらく GSDMB の膜挿入に影響を及ぼし、その孔形成活性を阻害します。 この IpaH7.8 による GSDMB の多方面からの阻害により、感染時に細胞傷害性リンパ球やナチュラルキラー細胞による攻撃から逃れる非常に効率的な方法が赤癬菌に与えられ 5、宿主の複製ニッチにおける細菌の生存が促進されます。

GSDMB 細孔のクライオ EM 構造は、細孔のオリゴマー化と脂質結合のドメイン間リンカーによって調節される独特の機構を示しています。 GSDMB はさまざまな細胞型および組織で広く発現されており 5、32、33、異なるドメイン間リンカーを持つそのアイソフォームは異なって制御されている可能性があります。 GSDMB アイソフォームの発現と活性におけるこのような違いは、おそらく GSDMB 活性化の細胞型固有の結果を微調整するための宿主戦略を表していると考えられます。 たとえば、ピロトーシス性の GSDMB アイソフォームは上皮細胞で優勢であり、感染細胞でのピロトーシスの誘導を通じて細胞内病原体の複製ニッチの排除に関与していますが、非ピロトーシス性アイソフォーム 1 はマクロファージや樹状細胞で優性であり、標的化して細胞を死滅させる可能性があります。パイロトーシスを誘導するのではなく、サイトゾル細菌を攻撃して、T 細胞活性化のためにこれらの抗原提示細胞の生存を確保します。 現在、各 GSDMB アイソフォームの細胞特異的分布、存在量、および機能は十分に理解されていません。 GSMDB アイソフォームと抗菌免疫の生理学的関連性については、さらなる研究が必要です。

GSDMB と GSDMD はどちらも一般に、細菌性病原体に対する自然免疫に関して重要です。 しかし、ヒトの GSDMB および GSDMD に干渉するシゲラなどの病原体は、宿主防御への寄与を最小限に抑えるため、ヒトがシゲラに感染しやすいのに対し、GSDMB を欠き、GSMDD が IpaH7.8 に対して感受性のないマウスが耐性を示す理由が説明されています 4,18。 注目に値するのは、赤癬患者は抗生物質を必要とせずに通常 5 ～ 7 日で回復するということ 34 であり、GSDMB と GSDMD は、IpaH7.8 の標的ではあるものの、依然として赤癬菌をヒトに感染させる役割を果たしている可能性があることを示唆しています。

細菌感染に加えて、GSDMB はさまざまな癌と関連しています。 最近の研究の 1 つでは、乳がん患者では非パイロトーシス アイソフォーム 2 の発現が他のアイソフォームよりも高いことが示されました 3。 アイソフォーム 2 および 3 の上方制御は腫瘍形成と転移を促進し、患者の全生存率を低下させる可能性がありますが、パイロプトーシス アイソフォーム 4 の高発現は逆の効果をもたらします 3。 GSDMB アイソフォームとがんの生存との間に潜在的な関連性があることを考慮すると、がん細胞が細胞傷害性リンパ球による攻撃に抵抗するために GSDMB アイソフォームの発現差を利用しているかどうかを探るため、さらなる研究が必要である。

全長 GSDM のコード配列を、N 末端 His6-SUMO タグの後に pET28-His-SUMO ベクターにクローニングしました。 クライオＥＭ構造決定に使用されるＧＳＤＭＢコンストラクトに関して、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（３Ｃ）部位（ＬＥＶＬＦＱ／ＧＰ）が残基Ｋ２３９の後に挿入された。 S.フレクスネリIpaH7.8のコード配列を、C末端6XHisタグを有するpET26bベクターにクローニングし、GSDMBとの共発現のためにアフィニティータグを持たないpET22bベクターにクローニングした。 カスパーゼ-11 (96-373) を pET22b ベクターにクローン化し、p20-p10 複合体の活性型を精製しました。 細胞実験では、GSDM (完全長) と GSDM-N を、C 末端に FLAG タグが融合された pcDNA3.1 ベクターにクローニングし、IpaH7.8 を pCMV-HA ベクターに挿入しました。 N末端HAタグを有する融合タンパク質。 この研究におけるすべての変異は、QuikChange 部位特異的変異誘発キット (Stratagene) または Gibson Assembly Master Mix (New England BioLabs) のいずれかを使用して導入され、すべてのプラスミドは配列決定によって検証されました。

GSDMB – IpaH7.8 複合体を得るために、pET28-His-SUMO-GSDMB および pET22b-IpaH7.8 の発現プラスミドを保有する大腸菌 BL21 (DE3) 細胞を、50 μg ml-1 カナマイシンを補充した溶原性ブロス培地で増殖させました。および 100 μg ml-1 アンピシリン、37 °C。 光学密度 (OD600) が 0.8 に達した時点で、20 °C で 16 時間、0.5 mM イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシドを添加することにより、タンパク質発現を誘導しました。 5,000gで20分間の遠心分離により細胞を収集した。 収集した細胞を、25 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、2 mM β-メルカプトエタノールおよび25 mM イミダゾールを含む緩衝液中で超音波処理により溶解した。 溶解物を 18,000 g、4 °C で 30 分間遠心分離して、不溶性画分を除去しました。 組換えタンパク質を含む上清を、製造業者の指示に従ってNi-NTAアガロース(Qiagen)を使用して精製した。 His6-SUMO タグの除去は、組換え Ulp1 を添加して、Ni-NTA カラム上で 4 °C で一晩実行されました。 フロースルー非タグタンパク質を、Hitrap Q HP イオン交換カラム (Cytiva) を使用してさらに精製し、次に Superdex Increase 200 (10/300) サイズ排除カラム (Cytiva) を使用して、25 mM HEPES pH 7.5 および 150 mM を含む緩衝液中で精製しました。 NaCl。 精製されたタンパク質はすべて、SDS-PAGE のクーマシーブルー染色によって確認されました。

in vitro ユビキチン化アッセイで使用される GSDM については His6-SUMO タグが保持されていることを除いて、すべての個々の GSDM、IpaH7.8 およびそれらの変異体の発現と精製に同様のプロトコルが適用されました。 すべての精製タンパク質は、使用前に約 5 ～ 10 mg ml-1 に濃縮されました。

GZMA プラスミド pET26b-GZMA は、J. Lieberman からの親切な贈り物でした 35。 E1 (pET21d-hUbE1)、E2 (pET15-hUbE2D2)、およびユビキチン (pET15-Ub) のプラスミドは、それぞれ C. Wolberger、W. Harper、および R. Klevit からの好意で寄贈されました 36、37、38。 発現と精製は以前のプロトコールに従いました。

インビトロユビキチン化反応は、緩衝液Ａ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ ２ および５ｍＭ ＡＴＰ）中で実施した。 成分は、0.4 μM E1 (ヒト UbE1)、2 μM E2 (ヒト UbE2D2)、10 μM E3 (IpaH7.8WT または IpaH7.8C357A 変異体)、200 μM ユビキチンおよび 10 μM GSDM (WT または示された変異体) の濃度で示されているように混合されました。 ）。 反応を 37 °C で 2 時間インキュベートし、SDS-PAGE ローディング色素を添加して反応を停止し、電気泳動前に 5 分間煮沸しました。 ユビキチン化は、SDS-PAGE のクーマシーブルー染色によって評価されました。

リポソーム漏出アッセイは、確立されたプロトコルに従って実施されました9。 簡単に説明すると、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンとPSまたはCL（Avanti Polar Lipids）をガラス管中で指定の比率で混合しました。 溶媒クロロホルムを窒素ガス流下で３０分間蒸発させた。 次いで、乾燥脂質フィルムを、５０ｍＭ ６－ＦＡＭ（東京化成工業）を添加した緩衝液Ｂ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で再水和した。 次に、ミニ押出機 (Avanti Polar Lipids) を使用して、6-FAM をロードしたリポソームを 1 μm 膜 (Whatman Nuclepore) を通して押し出しました。 カプセル化されていない 6-FAM を除去するために、押し出されたリポソームを緩衝液 B で平衡化した PD-10 脱塩カラム (Cytiva) に供しました。リポソーム漏出アッセイでは、リポソームを GSDMB/D および/または IpaH7.8 のタンパク質とともに、または含まずにインキュベートしました。活性化酵素 (GSDMB の場合は GZMA、GSMDD の場合はカスパーゼ-11p10/p20)。 反応は384ウェルプレート上で行い、SpectraMax M5プレートリーダー(Molecular Devices)を使用し、495 nmで励起し、1分間隔で60分間、517 nmの蛍光で6-FAM色素の放出をモニタリングした。

リポソームは、蛍光色素を使用しなかったことを除いて、上記のように調製した。 リポソームを、IpaH7.8の存在下または非存在下で、活性化酵素の存在下または非存在下で、さまざまなモル比でGSDMB/Dタンパク質とともにインキュベートしました。 混合物を4℃で30分間インキュベートした後、20,000gで4℃で30分間沈降させた。 上清を直ちに新しいチューブに移し、ペレットを緩衝液Bで2回洗浄し、次いで等量の緩衝液に再懸濁した。 次に、ペレットと上清の両方に含まれるタンパク質を、SDS-PAGE のクーマシー ブルー染色によって分析しました。

タグなし GSDM および IpaH7.8 のタンパク質濃度は、NanoDrop One Microvolume UV-Vis 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific) を使用して、吸光係数に基づいて 3 回測定されました。 等温滴定熱量測定は、VP-ITC マイクロ熱量計 (MicroCal) を使用して 20 °C で実行されました。 実験は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０および１５０ｍＭ ＮａＣｌ中の２ｍｌのＧＳＤＭＢ（１０μＭ）を含有するサンプルセルに２５０μｌのＩｐａＨ７．８溶液（２００μＭ）を注入することによって実施した。 合計 25 回の注射を 300 秒間隔で投与しました。 ヒトGSDMD（hGSDMD）およびマウスGSDMD（mGSDMD）に関しては、250μlのIpaH7.8溶液（625μM）を、2mlのhGSDMD（40μM）またはmGSDMD（40μM）を含むサンプルセルに滴定した。 すべての ITC データは、製造元が提供する Origin ソフトウェアを使用して分析し、1 部位結合モデルに適合させました。

293T 細胞は American Type Culture Collection から入手し、その形態学的特徴と機能に関して頻繁にチェックされました。 細胞は、10% (v/v) ウシ胎児血清 (Gibco) および 2 mM l-グルタミンを補充した DMEM (Gibco) 中で 37 ℃、5% CO2 インキュベーター内で増殖させました。 293T 細胞における一過性トランスフェクションは、リポフェクタミン 3000 (Thermo Fisher Scientific) を製造業者の指示に従って使用して実行しました。

細胞内の GSDMB ユビキチン化を検出するために、pcDNA-FLAG-GSDMB (アイソフォーム 1) を pCMV-HA-IpaH7.8 (WT または示された変異体) とともに 10 cm 組織培養皿内の HEK293T 細胞に同時トランスフェクトしました。 トランスフェクションの8時間後、最終濃度10μMのボルテゾミブ(Sigma Aldrich)を細胞培養物に添加して、プロテアソーム媒介タンパク質分解を減少させた。 さらに８時間後、細胞を収集し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ－４０および１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で溶解した。 ライセートを25μlのAnti-FLAG M2磁気ビーズ(Sigma Aldrich、番号M8823)に添加し、穏やかに回転させながら4℃で3時間インキュベートした。 ビーズをPBS緩衝液で3回洗浄し、次いで100μg ml-1 FLAGペプチド(Sigma Aldrich、番号F3290)を含む50μlのPBS緩衝液で溶出した。 溶出したサンプルを等量の 2× SDS ローディング バッファー (Bio-Rad) で煮沸し、次に以下の抗体の 1 つを使用してイムノブロッティングのために処理しました: 抗 FLAG (Sigma Aldrich、番号 F1804、1:1,000)、抗アクチン ( Cell Signaling Technology、no. 3700S、1:1,000）、抗 HA（Cell Signaling Technology、no. 3724S、1:1,000）、または抗ユビキチン（Thermo Fisher Scientific、no. PA3-16717、1:1,000）。

プラスミドpcDNA-FLAG-GSDMBおよびpcDNA-FLAG-GSDMD（250 ng）（WTまたは示された変異体）をそれぞれ1つずつ、500 ngのpCMV-HA-IpaH7.8プラスミドとともに12ウェルプレートに播種したHEK293T細胞にコトランスフェクトしました。ウェルあたり 1.5 × 105 細胞。 40時間後、細胞をRIPA緩衝液(Thermo Fisher Scientific)中で溶解し、等量の2×SDSローディング緩衝液(Bio-Rad)に添加し、イムノブロッティングのために処理した。

細胞死は、Hoechst/PI 二重染色アッセイによって決定されました。150 ng の指定された pcDNA-FLAG-GSDMB コンストラクトまたは 75 ng の pcDNA-FLAG-GSDMD プラスミド (FL、NT または指定された変異体) を、細胞内に播種した HEK293T 細胞にトランスフェクトしました。 96 ウェル プレート、ウェルあたり 2 × 104 細胞。 IpaH7.8 阻害の場合、pcDNA-FLAG-GSDMB-NT (アイソフォーム 4) を 200 ng の pCMV-HA-IpaH7.8 プラスミド (WT または C357A) と同時トランスフェクトしました。 次に、トランスフェクトされた細胞を最長 40 時間培養しました。 アッセイの開始時に、細胞を30μM PI (Sigma Aldrich)で10分間、続いて15μM Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific)で15分間、37℃、暗所で染色した。 その後、ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad) を使用して細胞を視覚化しました。 細胞死を定量化し、全細胞（ヘキスト染色細胞）中のPI陽性細胞の割合として表した。

大腸菌 DH5α を BHI 培地で一晩増殖させ、翌日 BHI で 1:100 に希釈し、対数増殖期まで 37 °C でさらに 2 時間増殖させました。 次に、5,000g で 2 分間遠心分離して細菌培養液 1 ml を収集し、最終細菌細胞密度が 5 × 108 ml-1 になるようにバッファー B に再懸濁しました。 死滅アッセイでは、GZMAの非存在下または存在下で、10μM完全長GSDMBを含む15μl反応液に5μlの細菌を添加した。 反応は 37 °C で 2 時間実行されました。 インキュベーション後、5μlの処理細菌を平底96ウェルプレート中の200μlのBHIに播種した。 細菌の増殖は、SpectraMax M5 プレートリーダー (Molecular Devices) を使用して 600 nm での吸光度を 6 時間にわたって読み取ることによってモニタリングしました。 回収されたコロニー形成単位（CFU）の数は、未処理細菌（緩衝液またはGZMAなし）に対する処理細菌（反応にGZMAあり）のOD600を正規化することによって計算されました。

精製したGSDMBアイソフォーム1を調製したリポソームに添加し、続いて3Cプロテアーゼを添加して細孔形成を開始した。 反応は氷上で３時間進行した。 GSDMB 細孔をロードしたリポソームを 2% C12E8 (Anatrace) で可溶化し、細孔を抽出しました。 挙動の悪い粒子と GSDMB-C を除去するために、バッファー B (25 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl および 0.006% C12E8) で平衡化した Superose 6 (10/300) Increase サイズ排除カラム (Cytiva) を使用してサンプルをさらに精製しました。 。

ネガティブ染色の場合、GSDMB-IpaH7.8 複合体または GSDMB 細孔 10 μl を、グロー放電されたカーボンコーティングされた銅グリッド (Electron Microscopy Sciences) に適用しました。 サンプルをグリッド上で 1 分間インキュベートし、1% 酢酸ウラニルで 1 分間染色し、拭き取って乾燥させました。 グリッドは、UCONN Health Electron Microscopy Facility の 2k CCD カメラ (Advanced Microscopy Techniques) を備えた Hitachi H-7650 透過型電子顕微鏡で画像化されました。

GSDMB-IpaH7.8 複合体の場合、0.5 mg ml-1 の新たに精製したサンプル 3.5 μl を、Vitrobot Mark を使用してプラズマグロー放電された Quantifoil 穴あき銅グリッド (R 1.2/1.3、400 メッシュ、電子顕微鏡サイエンス) に適用しました。 IV (Thermo Fisher Scientific) は、ブロッティング力 4、ブロッティング時間 5.5 秒、湿度 100%、4 °C に設定されました。 ブロットされたグリッドはすぐに液体エタンに浸され、保管のために液体窒素に移されました。 1 つのクライオ EM データセットは、ケース ウェスタン リザーブ大学のクライオ EM 施設で、K3 Summit 直接電子検出器 (Gatan) とポストカラム エネルギー フィルター (Gatan) を備えた Titan Krios 電子顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific) で収集されました。 SerialEMを使用したカウントモード。 合計 3,128 本のムービーが、倍率 ×105,000、ピクセル サイズ 0.414 Å で、-0.8 ～ -2.5 μm の範囲のデフォーカス値で記録されました。 各ムービーでは、およその合計線量 66.95 e-Å-2 で 5.25 秒にわたって 58 フレームが取得されました。

GSDMB 細孔の場合、界面活性剤で可溶化した GSDMB 細孔を 0.6 mg ml-1 に濃縮し、極薄カーボン フィルム (R 1.2/1.3、400 メッシュ、電子顕微鏡サイエンス) でコーティングされた Quantifoil 穴あき銅グリッド上で凍結させました。 簡単に言うと、3 μl 滴の GSDMB 細孔サンプルを、Vitrobot に取り付けられたプラズマ グロー放電されたレーシー カーボン グリッドに適用しました。 次いで、２秒の待ち時間の後、ブロッティング力１０で６秒間、グリッドを濾紙でブロットした。 Vitrobot 内の湿度と温度は、操作全体を通じてそれぞれ 100% と 4 °C に設定されました。 次に、ブロットされたグリッドを液体エタンに浸し、保管のために液体窒素に移しました。 クライオ EM データセットは、マサチューセッツ大学チャン医科大学のクライオ EM 施設で、K3 Summit 直接電子検出器 (Gatan) とポストカラム エネルギー フィルターを備えた Titan Krios 電子顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific) を使用して収集されました。 （ガタン）。 合計 6,376 個のムービーがカウント モードで収集され、各ムービーには 50 フレームが含まれ、総露光量は 50 e-1 Å-2 でした。 倍率は 105,000 に設定され、ピクセル サイズは 0.83 Å、焦点ぼけ範囲は -1.0 ～ -2.0 μm でした。

生のムービーは、ゲイン基準とビーム誘発の動きによって補正され、MotionCor2 (参考文献 39) を使用して動き補正画像に加算されました。 CTFパラメータはCTFFind4(参考文献40)を使用して決定され、後にcryoSPARC41で改良されました。

GSDMB-IpaH7.8 複合体の場合、crYOLO42 の一般モデルを使用して粒子を選択した後、座標 (合計 1,522,742 個の粒子) が後続の処理のために crioSPARC に転送されました。 氷、カーボンエッジ、およびノイズを含む偽陽性粒子を除去するために、数回の 2D 分類が実行されました。 307,276 個の粒子を含む頻繁に注目されるクラスが選択され、ab initio 3D 再構成とその後の不均一な改良が行われました。 均一かつ不均一な精製のために、113,959 個の粒子を含む最適なクラスが選択されました43。 最終的な電子密度マップの分解能は、ゴールドスタンダードのフーリエシェル相関 (FSC) 基準 0.143 に基づいて 3.8 Å と推定されました (参考文献 44)。 マップのローカル解像度分布は、ResMap45 によって決定されました。 図の作成には、cryoSPARC で鮮明化された密度マップが使用されました。

GSDMB 細孔の場合、cryoSPARC の手動および自動粒子ピッキングの両方によって、合計 692,212 個の粒子が最初に抽出されました。 氷、カーボンエッジ、およびノイズを含む偽陽性粒子を除去するために、cryoSPARC で 2 次元分類が実行されました。 2D 分類後、156,037 個の粒子が 3D 分類のために Relion-4.0 にインポートされ、同じ粒子セットを使用して crioSPARC で新規生成された初期モデルが使用されました。 C1 対称性は 3D 分類の最初のラウンドに使用されました。 C24 対称性の比較的明確な特徴を持つ 3D クラスが、不良粒子を破棄するための C24 対称性による追加の 3D 分類のために選択されました。 次に、最適な解像度を持つ 3D クラスからの 41,799 個の粒子が、不均一な精製のために crioSPARC にインポートされて戻されました。 C24 対称性により、GSDMB 細孔マップの分解能は、ゴールドスタンダード FSC 0.143 で測定すると 4.96 Å でした。 β バレル領域を除外したマスクによる焦点調整により、GSDMB 球状ドメインの局所解像度が 4.48 Å に向上しました。

IpaH7.8-GSDMB 複合体と GSDMB 細孔の両方の原子モデルが構築され、Coot46 と PHENIX47 を使用してクライオ EM 密度に精密化されました。 IpaH7.8 – GSDMB 複合体については、AlphaFold2 で予測された IpaH7.8 と GSDMB の構造を開始モデルとして使用しました 27。 IpaH7.8 と GSDMB のモデルは、UCSF Chimera48 の剛体として EM 密度にドッキングされ、Coot で手動で調整されました。 複合体の構造モデルは、「phenix.real_space_refine」を使用し、二次構造拘束と Coot を反復的に使用してさらに洗練されました。 原子モデルの品質は Molprobity49 によって評価されました。 GSDMB 細孔の場合、IpaH7.8-GSDMB 複合体における GSDMB の構造が開始モデルとして使用されました。 その後、さらに調整と改良を行うために、同様の手順が実行されました。 図は PyMOL (Schrödinger) と UCSF Chimera を使用して作成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

GSDMB-IpaH7.8 複合体、GSDMB 細孔、および β バレルを持たない GSDMB 細孔の原子座標は、アクセッション番号 2 でタンパク質データ バンク (PDB) に寄託されています。 それぞれ8EFP、8ET2、8ET1。 関連するクライオ EM 密度マップは、電子顕微鏡データ バンクに受託番号 2 で寄託されています。 それぞれEMD-28087、EMD-28584、EMD-28583。 他のすべてのデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。 この研究で使用した PDB データベース内のいくつかの構造座標は、アクセッション番号によって見つけることができます。 6CB8、5B5R、6N9O、6N9N、6VFE、7V8H、3CVR。

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議論してくださった S. Dou (QuintaraCT, Inc.)、X. Li および Y. Wang に感謝します。 この研究は、UConn Health Start-up Fund および米国国立衛生研究所 (JR への助成金番号 R01AI158435 および VAR への助成金番号 R01AI119015) によって支援されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Sonia Shivcharan、Tian Tian、Skylar Wright

米国コネチカット州ファーミントンのコネチカット大学ヘルスセンター医学部免疫学部

Chengliang Wang、Sonia Shivcharan、Tian Tian、Skylar Wright、Danyang Ma、Vijay A. Rathinam、Jianbin Ruan

米国マサチューセッツ州ウースター、マサチューセッツ大学チャン医科大学生化学・分子バイオテクノロジー部および極低温電子顕微鏡中核施設

JengYih Chang、Kankang Song、Chen Xu

クライオ電子顕微鏡コア、ケース ウェスタン リザーブ大学医学部、米国オハイオ州クリーブランド

李昆鵬

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JRとCWがこの研究を発案した。 CW、TT、および DM はタンパク質を発現および精製しました。 CW は GSDMB 細孔を再構成しました。 CW は JC、KL、KS、CXCW の支援を受けてグリッドをスクリーニングし、クライオ EM データを収集し、JR がクライオ EM 構造を決定しました。 CWとJRは生化学実験を実施した。 SS、TT、SW、CW は細胞実験を実施しました。 JRとVARがプロジェクトを監修した。 著者全員がデータを整理し、分析しました。 JR と CW は、すべての著者からの意見を得てこの論文を執筆しました。

阮建斌氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、GSDMB-IpaH7.8複合体のゲル濾過プロファイルおよびクーマシーブルー染色SDS-PAGE。 結果は 3 つ以上の独立した実験を表しています。 b. 単一粒子クライオ EM データ収集とプロセスの簡単なフローチャート。 c、ResMapを使用して計算されたGSDMB-IpaH7.8複合体のCryo-EMマップ（上のパネル）および局所解像度推定（下のパネル）。 最高の解像度は、IpaH7.8-LRR ドメインと GSDMB-N ドメインで観察されます。 GSDMB-C は比較的低い解像度を示します。 d. GSDMB-IpaH7.8 複合体のマップ全体およびモデル間の相関のゴールドスタンダード フーリエ シェル相関 (FSC) 曲線。

a、IpaH7.8-GSDMB複合体におけるGSDMB-Cの構造比較と報告されている結晶構造(PDB:5TJ2)。 色は、N 末端の青から C 末端の赤まで徐々に変化します。 b、ヒトGSDMとマウスGSDMDの構造に基づく配列アラインメント。 以前に報告された hGSDMD (PDB: 6N9O) および mGSDMD (PDB: 6N9N) の結晶構造、および AlphaFold2 で予測されたヒト GSDMA (hGSDMA)、ヒト GSDMC (hGSDMC)、およびヒト GSDME (hGSDME) の構造は、PROMALS3D を使用して GSDMB に対してアライメントされています。 GSDMB の二次構造要素は配列の上に示されています。 ドメイン間リンカーおよび C 末端サブドメインも示されています。 IpaH7.8 と相互作用する 2 つの構造要素は、それぞれ赤と緑のボックスでマークされています。 α1-β' ループ内の 3 つの負に荷電した残基は赤い点で示され、マウス GSDMD 内のアルギニン挿入 (mR20) は青い三角形で示されます。

a、GSDMB-IpaH7.8 複合体のインタラクション パッチ I の拡大図。 GSDMB はリボン図として表示されます。 2 つの負に帯電した残基が棒として示されています。 IpaH7.8は静電位として示されています。 IpaH7.8 内の R186 および H209 によって形成される 2 つの小さな塩基性ポケットと周囲の残基の間の距離が標識されています。 b、Shigella IpaH の LRR ドメインの配列アラインメント。 二次構造要素は配列の上に示されています。 普遍的に保存された残基は赤色の陰影でマークされ、部分的に保存された残基は赤色で表示されます。 インターフェースパッチ II および I に含まれる残基は、それぞれ赤い点と緑の三角形で示されます。 c、FLAGタグ付きGSDMBおよびHA-IpaH7.8（WTまたは示された変異体）を同時トランスフェクトした293T細胞のイムノブロット。 3 つの独立した実験を代表する結果。

a〜c、それぞれGSDMB（a）、ヒト（hGSDMD）（b）、およびマウスGSDMD（mGSDMD）（c）に対するIpaH7.8の結合親和性のITCに基づく測定。 Kd、解離定数。 N、錯体の化学量論。 DP、ITC マシンによって測定された差動電力。 ΔH、ITC マシンによって測定された熱変化。 平均値 ± SD を示します (n = 3)。 d〜f、GSDMB（d）、ヒトGSDMD（hGSDMD）（e）、またはマウスGSDMD（mGSDMD）（f）とインキュベートしたIpaH7.8のゲル濾過プロファイルおよびクーマシーブルー染色SDS-PAGE。 結果は 3 つ以上の独立した実験を表しています。 g、h、それぞれGSDMB-(g)またはヒトGSDMD-D17S/R20Ins(h)変異体とインキュベートしたIpaH7.8のゲル濾過プロファイル。 3 つの独立した実験を代表する結果。 i、IpaH7.8 と GSDM の間のインターフェイスの拡大図。 ヒト GSDMA (hGSDMA; AlphaFold2 予測)、ヒト GSDMC (hGSDMC; AlphaFold2 予測)、ヒト GSDMD (PDB: 6N9O)、ヒト GSDME (hGSDME; AlphaFold2 予測)、およびマウス GSDMD (PDB: 6N9N) の構造を GSDMB に重ね合わせます。 GSDMB-IpaH7.8複合体の構造。 各GSDMのIpaH7.8と相互作用するβ3鎖のアミノ酸配列を示す。 j、ヒトおよびマウスGSMDD（WTおよび示された変異体）のin vitroユビキチン化のクーマシーブルー染色SDS-PAGE。 mβ3 は、ヒト GSDMD の β3 鎖を対応するマウス配列で置き換えます。 GSDMBβ3 は、マウス GSDMD の β3 鎖を対応する GSDMB 配列に置き換えます。 突然変異は、in vitro でのユビキチン化を変化させませんでした。 3 つの独立した実験を代表する結果。

a、ゲル濾過プロファイルは、GSDMB と IpaH7.8-Y165E/Y166E 変異体または IpaH7.8-R186E/R228D 変異体との間に相互作用がないことを示しています。 結果は 3 つ以上の独立した実験を表しています。 ｂ、異なる用量のＩｐａＨ７．８（ＷＴ）とインキュベートしたときのリポソーム漏出を誘導するＧＳＤＭＢの能力。 各ドットは、3 回の技術的反復の平均 ± SD を表します。 c、リポソーム沈降アッセイにおけるIpaH7.8の存在下でのGSDMBとCL-リポソームの会合。 FL: フルレングス。 N: N末端ドメイン。 Ｃ：Ｃ末端ドメイン。 SDS-PAGE はクマシーブルーで染色されました。 3 つの独立した実験を代表する結果。 ｄ、ヒトＧＳＤＭＤが、異なる用量のＩｐａＨ７．８の存在下でＣＬ－リポソームのリポソーム漏出を誘導する能力。 各ドットは、3 回の技術的反復の平均 ± SD を表します。 e、IpaH7.8の存在下でのヒトGSMDDとCL-リポソームの会合を示すリポソーム沈降アッセイ。 3 つの独立した実験を代表する結果。 f、リポソーム沈降アッセイは、ユビキチン化または非ユビキチン化ヒトGSMDDとCL-リポソームとの会合を示す。 3 つの独立した実験を代表する結果。 g、リポソーム漏出アッセイは、ヒト GSDMD の細孔形成活性の阻害におけるユビキチン化の効果を示しています。 データは、界面活性剤の添加後に観察された蛍光を用いて正規化し、タンパク質添加の直前に蛍光をゼロに設定した。 各ドットは、3 回の技術的反復の平均 ± SD を表します。 ｈ、リジンがアルギニンに変異したＧＳＤＭＢ変異体のインビトロユビキチン化。 GSDMB の K177、K192、および K192 がアルギニンに変異した 3R。 SDS-PAGE はクマシーブルーで染色されました。 3 つの独立した実験を代表する結果。

GSDMB およびヒト GSDMD (PDB: 6VFE) の二次構造要素をそれぞれ配列の上と下に示します。 2 つの膜貫通ヘアピンがオレンジ色のボックスで強調表示されています。 GSDMB とヒト GSDMD の両方のリジンはすべて青色に色付けされています。 私たちの研究で細孔形成に関与すると予測され、ユビキチン化についてスクリーニングされたリジンは、青いボックスで強調表示されています。 GSDMB ドメイン間リンカーの「正規」シーケンスは、緑色のボックスで強調表示されます。 細孔のオリゴマー化と脂質結合を媒介する可能性のあるドメイン間リンカーの残基は、それぞれ赤い破線のボックスと青い背景で強調表示されています。

a、Shigella IpaH7.8によるGSDMBアイソフォームのインビトロユビキチン化。 SDS-PAGEローディングバッファーで煮沸することにより0分で終了したユビキチン化反応を、非ユビキチン化陰性対照として使用した。 SDS-PAGEはクーマシーブルーで染色しました。 3 つの独立した実験を代表する結果。 b、CL-リポソームを使用したリポソーム漏出アッセイによって示された、GSDMBアイソフォーム6の細孔形成活性の阻害におけるユビキチン化の効果。 各ドットは、3 回の技術的反復の平均 ± SD を表します。 c、GZMAによるGSDMBアイソフォームの切断。 3.6μgのGSDMBアイソフォームをそれぞれ1μgのGZMAとインキュベートしました。 切断は、混合物を 37 °C で 2 時間インキュベートすることによって実行されました。 白 * は GSDMB-NT を示します。 アイソフォーム 2 の GSDMB-NT の分子量 (25.9 kDa) は GZMA (25.8 kDa) に非常に近く、SDS-PAGE では分離できません。 SDS-PAGEはクーマシーブルーで染色しました。 3 つの独立した実験を代表する結果。 d、HEK293T細胞におけるピロトーシスの誘導におけるGSDMBアイソフォームの効果。 FL: 全長 GSDMB。 NT: GSDMB の N 末端ドメイン。 スケールバーは100μmです。 3 つの独立した実験を代表する結果。 e、GSDMBアイソフォーム4媒介HEK293T細胞のパイロトーシス細胞死の阻害におけるIpaH7.8の効果。 3 つの独立した実験を代表する結果。 スケールバーは100μmです。 f、(e)の細胞死の定量。 エラーバー、3 つの独立した実験の平均 ± SD。 一元配置分散分析とそれに続く Tukey の事後検定を、GSDMB-NT のプラスミドと空のベクターでトランスフェクトされた HEK293T 細胞のコントロールと比較しました。 ** p < 0.005。 g、細菌増殖の阻害におけるGSDMBアイソフォームの効果。 エラーバー、3 つの独立した実験の平均 ± SD。 一元配置分散分析に続いて、サンプルを非切断対照と比較した Tukey の事後検定。 *、p < 0.1、***、p < 0.001、NS: 有意ではありません。

a、界面活性剤C12E8を使用してカルジオリピン-リポソームから抽出されたGSDMBアイソフォーム4および6の細孔の代表的なネガティブ染色EM画像。 スケールバー: 50 nm。 結果は 3 つ以上の独立した実験を表しています。 b、C12E8に可溶化されたGSDMBアイソフォーム1細孔の代表的なネガティブ染色EM画像（左パネル）、およびK3カメラを備えたTitan Krios顕微鏡で収集されたGSDMBアイソフォーム1細孔のクライオEM画像。 結果は 3 つ以上の独立した実験を表しています。 スケールバー: 50 nm。 c、単一粒子クライオEMデータ収集とGSDMB細孔データセットのプロセスの簡単なフローチャート。 d、GSDMB細孔のハーフマップ相関のゴールドスタンダードフーリエシェル相関曲線。

a、GSDMB プレポアのゴールドスタンダード FSC 曲線。 b. クライオ EM マップ (左) および 24 倍 GSDMB プレポアの原子モデルを当てはめたクライオ EM マップ (右)。 GSDMB プロトマーの色は異なります。 GSDMB プレポアには膜貫通挿入領域がありません。 赤い破線のボックスは、欠落している膜貫通領域を示しています。 c、GSDMB細孔βヘアピン（HP）の形成。 最初の伸長ドメイン (ED1) の β3 ～ β5 領域が HP1 に形質転換します。 β7-α4-β8 領域は ED2 を表し、HP2 になります。 d, GSDMB 細孔内の 2 つの隣接するサブユニット。 オリゴマー化に関与する構造要素はラベル付けされ、黄色に色付けされます。 e、f、hGSDMD細孔(e)およびGSDMB細孔(f)におけるドメイン間リンカーのCryo-EM密度がそれぞれ示されている。 全体の密度は灰色で示され、hGSDMD 細孔および GSDMB 細孔内のドメイン間リンカーの密度はそれぞれピンク色とマゼンタ色で示されています。 ドメイン間リンカーは赤色で表示されます。 g、GSDMBアイソフォーム1のドメイン間リンカー領域1の拡大図。ドメイン間リンカーと相互作用する隣接するサブユニットからのヘリックスα3'は黄色で示されている。 ｈ、リポソーム（１０％ＰＳ）漏出の誘導における、ＧＳＤＭＢアイソフォーム１および４のドメイン間リンカーにおける領域１の変異の影響。 各ドットは、3 回の技術的反復の平均 ± SD を表します。 WT: 野生型 GSDMB。 領域 1: GSDMB の領域 1 モチーフの「GGGG」への変異。 i、j、HEK293T細胞をGSDMBアイソフォーム4(i)およびhGSDMD(j)の示された構築物で24時間一過的にトランスフェクトし、Hoechst 33342およびPIで染色した。 FL: 全長。 NTWT: 野生型 GSDMB/D-NT。 NTBS4: GSDMB アイソフォーム 4 および hGSDMD の 3 つの塩基性残基から BS4 のグルタミン酸への三重変異を有する GSDMB/D-NT。 3 つの独立した実験を代表する結果。 スケールバーは100μmです。

このファイルには、切り取られていない免疫ブロットが含まれています (補足図 1 および 2)。

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転載と許可

Wang、C.、Shivcharan、S.、Tian、T. 他。 GSDMB 細孔形成の構造基盤と IpaH7.8 によるその標的化。 ネイチャー 616、590–597 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-05832-z

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受信日: 2022 年 10 月 18 日

受理日: 2023 年 2 月 13 日

公開日: 2023 年 3 月 29 日

発行日: 2023 年 4 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05832-z

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