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May 23, 2023

年齢確認

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 2836 (2023) この記事を引用

745 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ウイルス性脳炎における重要な出来事の 1 つは、ウイルスが中枢神経系 (CNS) に侵入する能力です。 ラクロスウイルス（LACV）を含むいくつかの脳炎ウイルスは、主に小児に脳炎を引き起こしますが、成人には引き起こしません。 この現象は LACV マウスモデルでも観察されており、ウイルスはおそらく脳毛細血管内皮細胞 (BCEC) を介した脳微小血管の血管漏出を介して離乳期の動物の中枢神経系に侵入します。 血管漏出の年齢および領域特異的な制御因子を調べるために、ゲノムワイドのトランスクリプトミクスと標的siRNAスクリーニングを使用して、その抑制がBCECにおけるウイルスの病因に影響を与える遺伝子を同定しました。 これらの遺伝子産物のうちの 2 つ、Connexin43 (Cx43/Gja1) および EphrinA2 (Efna2) をさらに分析したところ、LACV の病因に対する実質的な影響が示されました。 4-フェニル酪酸 (4-PBA) による Cx43 の誘導は離乳期マウスの神経疾患を抑制しましたが、Efna2 欠損により成体マウスの疾患が増加しました。 したがって、BCECによって発現されるEfna2およびCx43が、LACV誘発性の神経浸潤および神経疾患の重要なメディエーターであることを示します。

ラクロスウイルス (LACV) はブニヤウイルス科に属するネガティブセンス RNA ウイルス 1 であり、小児におけるアルボウイルス性脳炎の主な原因の 1 つです 2。 成人の場合、LACV 感染は一般に非常に軽度の発熱症候群を引き起こします3。 成人と比較して小児の神経疾患の発生率が高いことは、ウイルスが中枢神経系（CNS）にアクセスする能力、および/またはCNS内に損傷を引き起こす能力の原因となっている可能性のある年齢に関連した差異を示唆しています。 これらの違いを理解することで、LACV 脳炎の予防または治療の道が開かれる可能性があります。

血液脳関門 (BBB) は、CNS への病原体の接近を阻害する際に重要な役割を果たす選択的透過性の関門です。 血液脳関門（BBB）は、主に脳毛細管内皮細胞（BCEC）と隣接する星状膠細胞、基底膜、周皮細胞で構成されており、これらは周囲のニューロンやミクログリアと相互作用して神経血管単位を形成します4。 BCEC を通過する選択的透過性は、タイトジャンクション (TJ)、アドヘレンスジャンクション (AJ)、およびギャップジャンクション (GJ) (総称して細胞結合 (CJ)) タンパク質に加え、いくつかのトランスポーターおよびキャリアタンパク質によって定義されます 5,6。 BBB の完全性は開発中に強化されます 7,8。 それは成人期にピークに達し、その後、CJタンパク質発現の減少とトランスポーターの機能障害により、年齢とともに徐々に弱まっていきます9、10。

LACV 脳炎から観察される病理は、BBB の実質的な破壊を示しています。 LACV 患者の脳生検の免疫組織化学 (IHC) 分析では、免疫細胞の局所的な凝集を伴う血管周囲の単核カフィングが示されており 11、さらなる研究により LACV 脳炎によって誘発された血管損傷が実証されています 12。 したがって、LACV 脳炎は神経血管の病理および異常と密接に関連しています。

同様に年齢依存性の LACV 脳炎および血管病理が C57BL/6 マウス モデルでも観察されます。 離乳マウス（～3週齢）はCNSのLACV感染に非常に感受性が高く、末梢（腹腔内、IP）または直接CNS感染（脳内、IC）のいずれかに続いて臨床疾患を発症します。 対照的に、6 週齢以上の成体マウスは末梢感染 (IP) には耐性がありますが、CNS (IC) の直接感染には影響されやすい 13、14、15。 したがって、末梢感染後にCNSにアクセスするLACVの能力には明らかな年齢関連の差が存在する。

年齢に関連した感受性に関する研究では、LACV 感染後の若いマウスにおける血管漏出と BBB の破壊の増加が示されています。 LACV に感染した BCEC は生体内では容易に観察されませんが、BBB の破壊は、皮質 (CT) ではなく、特に嗅球 (OB)/前嗅核 (AON) 領域の微小血管/BCEC を介した漏出によって媒介されます。 ）地域16． ウイルス漏出は一般に感染後 3 日 (dpi) でピークに達し、この血管漏出に関連する領域でニューロンのウイルス感染が観察されます。 以前の研究で、我々は、脳微小血管/BCECの年齢特異的反応が異なる細胞変性効果とLACV感受性を引き起こすことを実証しました。 さらに、ex vivoで単離した脳微小血管断片と、離乳期および成体マウスから単離した初代BCECのin vitro培養を用いて、離乳期のBCECがLACV感染、合胞体様凝集体の形成、および傍観者細胞死を起こしやすいことを示しました17。 BCEC 応答は、宿主免疫応答、細胞生存、機能的 CJ タンパク質の発現、血管の維持、または多遺伝子相互作用を含むいくつかの要因によって制御されている可能性があります。 LACV 感染時の離乳期と成人の脳の微小血管/BCEC で異なる要因を特定することにより、LACV の神経浸潤を防ぐ上で重要な要因についての洞察が得られる可能性があります。

我々は、LACV抵抗性成体マウスでは推定上の制限因子が存在するか増強されているのに対し、LACV感受性の離乳マウスでは推定上の感受性因子が優勢である可能性があると仮説を立てた。 このような因子を同定するために、我々はまず、離乳マウスおよび成体マウスから得られたエクスビボで単離された脳微小血管断片においてRNA配列決定（RNA-seq）に基づくトランスクリプトーム解析を使用し、ウイルス誘発性を模倣するポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリI:C）に対する応答を評価した。免疫刺激。 さらに、LACV感染または疑似接種された離乳マウスのOBおよびCT領域から単離された脳微小血管断片のRNA-seqプロファイルを比較しました。 これらの分析で差次的発現プロファイルを示す候補遺伝子を標的低分子干渉RNA（siRNA）スクリーニングに供し、年齢依存性LACV感受性の推定制御因子を同定した。 ヒット遺伝子は、LACV 感染経路に関与する可能性のある部位について評価され、ギャップ結合タンパク質 α 1 (Gja1) とエフリン A2 (Efna2) の 2 つの遺伝子が、LACV 誘発性の血管漏出と血管の確立を制御する潜在的な治療標的として同定されました。神経感染症。

我々はまず、LACVに対する年齢依存性の感受性に寄与する候補遺伝子制御因子を同定しようとした。 離乳期マウス（W）および成体マウス（A）を、ポリI:C（PI）（ウイルスRNA刺激の代用として）またはビヒクル対照（V）のいずれかで3時間処理しました。 これらのマウスから単離された全脳微小血管断片をRNA-seq分析に供し、本質的に年齢依存性の遺伝子またはPoly I:C刺激誘導性の遺伝子の両方を同定した（図1a）。 離乳期ビヒクル（WV）群と成人ビヒクル（AV）群を比較して、基礎レベルの年齢に関連した差異について遺伝子発現を比較しました。 活性化の比較は、離乳期ポリ I:C 刺激 (WPI) 対 WV、成体ポリ I:C 刺激(API) 対 AV、および WPI 対 API を比較することによって行われました。 上記の比較から、差次的遺伝子発現火山プロットと経路濃縮分析（Ingenuity Pathway Analysis、IPA）は、異なる治療法と年齢グループを区別する細胞プロセスを強調表示します（補足図1a〜d）。 さらなる評価のための特定の遺伝子は、log2の差が1以上、p < 0.05、およびベース平均が100以上のグループ間の発現差に基づいて選択されました（補足表1、グループ1）。 単離された微小血管フラグメント内の考えられる細胞組成を評価するために、RNA 配列データから細胞型特異的遺伝子の発現を評価しました (補足表 2)。 これは、BCEC 特異的遺伝子が高度に濃縮され、周皮細胞マーカーの中程度/低発現があるが、星状細胞、ニューロン、および平滑筋細胞に特徴的な遺伝子の発現が非常に少ないことを示しました。 これにより、以前に記載されているように、微小血管フラグメントの調製に使用された方法により、高度に特異的な BCEC 濃縮が得られることが確認されました 18、19、20。

a ビヒクル (V) または Poly I:C (PI) で処理した離乳期 (W) または成体 (A) マウス (WV、WPI、AV、および API) の RNA-seq 解析から標的遺伝子を選択するための逐次アプローチ。 b 離乳期のLACV感染マウス（LOBおよびLCT）および模擬接種マウス（MOBおよびMCT）の嗅球（OB）および皮質（CT）領域の微小血管断片のRNA-seq分析からの標的遺伝子の同定（すべてのRNAについてN = 3） -seq サンプル)。 betaPrior = FALSE のデフォルトの DESeq 関数が適用され、有意性の Wald 検定による負の二項一般化モデルが実行されました。 両側 p 値は、Benjamini Hochberg 法を使用した複数の検定用に補正されました。 c – e 離乳期モック（WM）、離乳期LACV（WL）、成体モック（AM）および成体LACV（AL）感染マウスからex vivoで単離した微小血管断片に対するリアルタイムPCR分析によって検証された、代表的な遺伝子の発現差。 遺伝子カテゴリー: (c) 内因性成人特異的 (Efna2 および H2q6 WM 対 AM P = 0.0032 および P = 0.0001、および WL 対 AL P = 0.0002 および P = 0.0356)、d 内因性離乳期特異的 (Bst1 および Mmp25 WM 対AM P < 0.0001および P = 0.1010およびWL対AL P < 0.0001およびP = 0.4684）または（e）LACV感染誘導性の成人増強遺伝子（Clec4eおよびCldn1の場合WM対AM P = 0.0453およびP = 0.0894およびWL対AL 0.6490 および P = 0.5686)。 f LACVに感染した成体（AOBおよびACT）および離乳子（WOBおよびWCT）から得られたOBおよびCT微小血管断片からの代表的な遺伝子の差次的発現。 WOB 対 WCT の比較では、Aqp1 および Ttr について P = 0.0043 および P = 0.0068、AOB 対 ACT の比較では、Aqp1 および Ttr について P = 0.0417 および P < < 0.0001。 （c〜f）のデータは、より正規分布になるようにlog2スケールに変換され、変換後にデータポイントが統計的に分析またはプロットされました。 有意値は、一元配置分散分析とその後のテューキーの多重比較 (c-e) または両側の複数の対応のない t 検定 (f) によって測定されました (パネル c-f および個別のすべてのマウス実験で N = 5-6)データポイントが表示されます)。 (*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、および ****P < 0.0001)。

LACV 感染後に BBB 完全性の地域差が観察され、ウイルス感染は離乳期マウスの OB 領域で最初に観察されるため 16、本発明者らは、LACV 感染 (L) およびモックマウスの異なる領域から単離された微小血管断片の RNA 配列解析も完了しました。 3 dpi で離乳期マウスの脳に接種 (M)。 この比較からの遺伝子は、2 つの異なる遺伝子発現基準に基づいて選択されました。LACV 感染マウスの OB (LOB) と疑似感染マウスの OB (MOB) からの微小血管断片間の発現の違い、または遺伝子の違いのいずれかです。 LACV感染マウスのCT（LCT）からの微小血管断片に対するLOB間の発現（図1b）。 これらの基準は、さらなる分析のために追加の遺伝子を選択するために使用されました (補足表 1、グループ 2)。 これらの比較からの差次的な遺伝子発現とIPA分析は、OBのLACV感染後のインターフェロンと神経炎症の予想される濃縮、およびOB / CT比較におけるギャップ結合とエフリンシグナル伝達の違いを強調しています（補足図1e、f）。 最後に、選択したグループ 1 および 2 の遺伝子に加えて、BBB 機能および LACV に対する宿主免疫応答に影響を与えることが知られている遺伝子も含めましたが、上記の RNA 配列分析では必ずしも区別されませんでした (補足表 1、グループ 3 および 4、それぞれ）。

選択した遺伝子の発現の違いをさらに確認するために、LACV 感染後の qPCR によって発現を分析しました。 LACV に感染した成体 (AL) または離乳期 (WL) マウス、および疑似接種された離乳期 (WM) および成体 (AM) マウスから得られた微小血管断片から 3 dpi で RNA を抽出しました。一方、追加の微小血管断片は OB および成体から抽出されました。 LACV 感染 (3 dpi) 離乳期および成体マウスの CT 領域。 ex vivoで単離された微小血管断片のリアルタイムPCR分析により、遺伝子が成人強化型、離乳期強化型、LACV誘導型、領域特異的（OB-CT）の4つの主要なカテゴリーに分類されることが示されました（図1c〜f）。 たとえば、エフリンA2（Efna2;血管新生分子）とH2q6（MHCクラスIファミリーに属する）は、ウイルス感染に関係なく、成体の微小血管断片でより高いレベルで発現されました（図1c）。 骨髄間質細胞抗原 1 (Bst1; 免疫調節因子) およびマトリックスメタロペプチダーゼ 25 (Mmp25) は、離乳期のマウスでより高い基礎レベルを示しました (図 1d)。 C型レクチンドメインファミリー4のメンバーe（Clec4e、LACVを認識し、LACV21に対する初期の抗ウイルス反応において限定的な役割を果たす分子）およびクローディン1（Cldn1、内皮/上皮細胞に存在するTJタンパク質）は、LACVによって増加した成体マウスでは感染しますが、離乳期マウスでは感染しません（図1e）。 OB 微小血管フラグメントと CT 微小血管フラグメントの間で差次的に発現された遺伝子はわずかでした。 これらのうち、2 つの恒常性維持遺伝子であるアクアポリン 1 (Aqp1; 受動輸送体) とトランスサイレチン (Ttr; キャリアタンパク質) は、離乳期 (WCT) マウスと成体 (ACT) マウスの両方から得られた CT 微小血管断片において、マウスから得られた OB 微小血管断片と比較して増加していました。離乳期（WOB）マウスと成体（AOB）マウス。 OB と CT の微小血管フラグメント間のペアワイズ比較を各年齢グループごとに示します (図 1f)。 したがって、RNA配列（図1a、b）およびqPCR分析（図1c〜f）によって、さらなる研究のために、年齢、感染症、または地域ごとに微小血管断片で異なる発現を示す遺伝子を同定しました。

選択した遺伝子がウイルスの病因に影響を与えるかどうかを直接調べるために、内皮細胞LACV感染のin vitroモデルを利用しました。 我々は以前、感染した内皮細胞は in vivo では容易に検出できないが、in vitro では年齢依存的に感染し、この感染が内皮細胞への直接的および傍観的損傷と関連していることを発見した 17 。 遺伝子摂動細胞ベースのスクリーニングアッセイを確立するために、マウス内皮腫細胞株 bEnd.3 を選択しました。これらの細胞は LACV に感染する可能性があり、siRNA トランスフェクションを容易に受けられるためです。 siRNA 送達を最適化するために、致死および非ターゲティング (NT) コントロール siRNA を使用してさまざまなトランスフェクション試薬をテストし、si-NT コントロールで最大の生存率を維持しながら致死 siRNA で最大の細胞死滅をもたらす条件を特定しました。 これにより、50 nM siRNA と Transit TKO トランスフェクション試薬を使用した最適な送達プロトコルが特定されました（補足図 2a）。 次に、スクリーニングのための 3 つの対照条件を確立しました: a) NT siRNA による LACV 感染のベースライン条件、b) Ifnar1 および Ifnar2 に対する siRNA の組み合わせを使用した既知の制限因子の対照 (si-Ifnar または si-Upreg。対照)。上方制御されたLACV感染）およびc）クラスリン重鎖およびRab5aに対するsiRNAの組み合わせを使用した既知の感受性因子の対照（si-CltcRabまたはsi-Downreg。対照;下方制御されたLACV感染）（補足図2b、c）。

次に、補足表に示す 35 個の選択された遺伝子をスクリーニングしました。 図１は、室温におけるＢＣＥＣ単層上のＬＡＣＶ感染の３つの異なる段階における３つの対照条件とともに示されている。 1 つ目は初期段階 (6 hpi、図 2a) であり、ウイルスの侵入に対する影響を示唆しています。 2番目は内側感染期（24hpi、図2b）で、ウイルスの複製と内皮細胞培養物を介した拡散に対する影響を示唆しています。 これらの動態段階は、別の細胞株における LACV 感染でも同様に観察されています 22。 これらの最初の 2 つのフェーズの細胞ベースのアッセイでは、抗 LACV 抗体を使用して、細胞ごとにウイルスの蛍光強度を測定しました。 これは、LACV 合計強度 (感染細胞数と感染強度の両方の影響を受ける) を測定し、ヘキスト面積に対する比率を定量することによって決定されました (強度値を総細胞数に対して正規化します)。 最後の後期アッセイ (72 hpi、図 2c) では、LACV 誘導細胞死による細胞損失を測定しました。 これらの基準を使用すると、推定制限因子のノックダウンは LACV 強度の増加と細胞生存率の低下をもたらすと予想されますが、一方、推定感受性因子のノックダウンは LACV 強度の低下と細胞生存率の向上につながります。 推定上の耐性または感受性の表現型を示す2つの遺伝子クラスターを特定しました（図2a〜cで強調表示された色）。ウイルスの上方制御または下方制御の代表的な画像を補足図3に示します。

bEnd.3 細胞を、ウイルス上方制御コントロール (すなわち、si-Ifnar1 および Ifnar2、si-Upreg コントロールと略称)、下方制御コントロール (すなわち、si -Cltc および Rab5a、si-Downreg. Control と略記）、非ターゲティング（si-NT、点線）および細胞死（si-Lethal）コントロール（示されている場合）。 a、b 6 hpi (a) および 24 hpi (b) での si-NT (LACV 強度の合計とヘキストの面積比) に対して正規化した感染度 (LACV の 10 MOI) の分析。 c 72 hpi での細胞生存 (核数) の分析。 最初のバーは 2 つの独立した遺伝子特異的 siRNA の平均を表し、次の 2 つのバーは各遺伝子の siRNA#1 および #2 を表します (平均 ± SD、N = 3 それぞれの個別の siRNA)。 推定上のヒット遺伝子は、さまざまなグラフにわたって色が一致しています。

一次スクリーニングで同定された推定上の制限因子には、Efna2、Clec4e、Gja1 (Connexin43 タンパク質として発現、Cx43 と略記)、インターフェロン誘導膜貫通タンパク質 3 (Ifitm3、RNA ウイルス制限因子)、リンパ球抗原 6 複合体遺伝子座 C2 (Ly6c2) およびH2q6. H2q6の場合、6時間と24時間の間で表現型に変動があり、ウイルス強度の増加は初期の時点でのみ観察されました（図2a、b）。 H2q6 ノックダウン培養物では、合胞体様の凝集と多核細胞のクラスターが観察されました。これは、ウイルス強度の増加表現型の初期時点への制限を説明する可能性があります (白い矢印、補足図 3a、b)。 Gja1 ノックダウンは細胞単層の解離を引き起こし (白い矢印、補足図 3b)、これはギャップ結合の完全性におけるその確立された役割と一致しています。 推定の感受性因子には、血管内皮増殖因子A（Vegfa）、アクチン細胞骨格リモデリングタンパク質ゲルゾリン（Gsn）、クローディン2（Cldn2）、クローディン5（Cldn5）およびタイトジャンクションタンパク質2（Tjp2 / ZO2）が含まれます（図2a〜c） ）。 したがって、bEnd.3 内皮細胞の LACV in vitro 感染を増強または減少させる複数の遺伝子が同定されました。

標的siRNAスクリーニングに基づいて、初代成人および離乳期のBCECでのさらなる検証のために、7つの推定上の制限因子（Group1遺伝子：Bst1、Efna2、H2q6、Clec4e、Gja1、Ifitm3およびLy6c2）を選択しました。 興味深いことに、これらの遺伝子すべてをノックダウンすると、成人の原発性BCECのLACV感染に対する感受性が増加しましたが（図3a）、Ifitm3ノックダウンのみが離乳期の原発性BCECの感染レベルの有意な増加を示しました（図3b）。成人BCECにおけるLACVに対する耐性の増加に寄与します。

a、b 成体 (a) および離乳期 (b) の初代 BCEC を、示されたグループ 1 ヒット遺伝子 (主に制限因子) に対して 50 nM siRNA で 72 時間トランスフェクトし、LACV 感染 (LACV 強度の合計とヘキストの面積比) を評価（N = 6、個々のデータポイントが表示されます）ここで、（a）の P = 0.0162、0.0085、0.0153、0.0830、0.0394、0.0636、0.0231、0.0271、および P = 0.6571、0.9010、0.0960、0.1548、 0.9290、0.0354、0.0649 (b) では、si-Bst1、si-Efna2、si-H2q6、si-Clec4e、si-Gja1、si-Ifitm3、si-Ly6c2、および si-Upreg については <0.0001。 それぞれコントロールとsi-NT。 c 50 nMの指定された遺伝子特異的siRNAおよび対照siRNAを72時間トランスフェクトし、10 MOIのLACVを24時間感染させたbEnd.3細胞におけるLACV付着/侵入アッセイ。 d Ifitm3およびLyc2 siRNAにおけるLACVの付着/侵入の代表的な画像は、bEnd.3細胞を混乱させました（緑：LACVおよび青：Hoechst）（c、dのN = 3）。 ここで、P = 0.0682、0.0752、0.9479、0.3786、0.3018、0.0009、0.0020および0.9574インチ(c、左)およびP = 0.0980、0.9622、0.6042、0.4154、0.9939、0.013 2、0.0011 および 0.0294 インチ (c、右) si-Bst1、si-Efna2、si-H2q6、si-Clec4e、si-Gja1、si-Ifitm3、si-Ly6c2、si-Upreg。 それぞれコントロールとsi-NT。 e プラークアッセイ（各ドット = 1 サンプル）は、50 nM の示された遺伝子特異的 siRNA で 72 時間トランスフェクトされた LACV 感染 bEnd.3 細胞において 24 hpi で実行されました。 ここで、si-Bst1、si-Efna2、si-H2q6、si-Clec4e、si-Gja1、si-Ifitm3、si-Ly6c2 と si-NT の P = 0.5075、0.0030、0.7566、0.1347、0.0120、0.7941、0.0156、それぞれ。 f bEnd.3 細胞を 50 nM の指定の siRNA で 72 時間トランスフェクトし、10 MOI LACV で感染させ、共焦点顕微鏡を使用して LACV 感染 (緑色)、アクチン (赤色: ファロイジン) および核 (青色: Hoechst) を画像化しました。 a、b si-NT と標的遺伝子の間の複数の両側対応のない t 検定および c-e の複数の対応のない両側 t 検定を実行しました（* P < 0.05、** P < 0.01、***） P < 0.001 および ****P < 0.0001) および平均 ± SD (条件ごとに 3 ～ 6 サンプル) が表示されます。 d、f 画像は 25 ～ 75 の独立したフィールドを表しています。 スケール バー = 100 um (白、通常の画像の場合)、スケール バー = 10 um (黄色、ズームイン画像の場合)。

また、初代培養での検証のために推定の感受性因子もテストしました（グループ 2 遺伝子：Cldn2、Tjp2、Cldn5、Vegfa、Mmp8、Mmp25、および Gsn）。 離乳期の増強遺伝子である Mmp25 のノックダウンにより、成体および離乳期の初代 BCEC の両方で LACV 強度が低下し（図 S4）、この宿主遺伝子が LACV 感染を促進する可能性があることが示唆されました。 しかし、原発性BCECにおける他の推定感受性因子については、わずかな影響しか観察されなかった。 初代細胞ではグループ 1 遺伝子のヒット検証の頻度が高いことが観察されたため、さらなる分析のためにこのグループの遺伝子に焦点を当てました。

ウイルス阻害のメカニズムを詳しく解明するために、我々は次に bEnd.3 細胞を利用して、推定上の制限因子の混乱がウイルスの複製を制限する可能性がある段階を調べました。 付着/侵入アッセイ（低温でのウイルス結合の誘導、方法のセクションを参照）は、2つの遺伝子、Ly6c2およびIfitm3がウイルスの侵入を制限することを示しました（図3c）。 si-Ly6c2と比較して、si-Ifitm3ノックダウンは、感染細胞数および細胞あたりのLACV強度の上方制御をより小さく引き起こしました（図3c、d）。 次に、プラークアッセイを実施したところ、Ly6c2、Gja1、およびEfna2の摂動により、24 hpiでウイルス産生が増加することがわかりました（図3e）。

私たちの一次スクリーニングでは、H2q6遺伝子のノックダウンもbEnd.3細胞で合胞体様の凝集形成を誘導することに注目しました（補足図3a、b）。 これをさらに調査するために、対照細胞および H2q6 摂動 bEnd.3 細胞を LACV と F-アクチンの両方について共染色しました。 LACV 感染後に OB BCEC でアクチン細胞骨格タンパク質が変化することが以前に報告されています 16。 我々は、LACVが対照細胞、特に細胞周縁部および葉状仮足伸展部のアクチンネットワークと共局在することを観察した（細い矢印、上部パネル、図3f）。 しかし、H2q6 ノックダウン条件では、特に 2 つ以上の核を持つ細胞 (シンシチウム様の凝集を形成) では、規則的な糸状アクチン染色と、細胞核の周囲に位置するアクチンおよび LACV の顆粒染色の破壊が観察されました (太い矢印、下のパネル) 、図3f)は、ウイルス輸送の潜在的な変化を示唆しています。 したがって、我々の焦点を絞ったsiRNAスクリーニングから特定された推定上のウイルス制限因子（Efna2、H2q6、Clec4e、Gja1、Ifitm3）のin vitro検証は、LACVにおけるウイルス侵入、輸送、またはウイルス粒子放出の制限または変更における選択された宿主遺伝子の役割の可能性を示唆しています-感染した内皮細胞。

内皮細胞の LACV 感染に大きな影響を与えた主要な遺伝子の 1 つは Efna2 であり、これは成人 BCEC に本質的に豊富に存在します。 コードされた EFNA2 タンパク質は、エフリン A (EphA) クラス受容体 24 を介してシグナル伝達応答を実行する血管新生因子 23 です。 EFNA2をさらに調べるために、組換えマウスEFNA2（rec-EFNA2）タンパク質が離乳期および成人の原発性BCECにおけるLACV感染を制限できるかどうかを試験しました。 離乳期および成体の初代BCECを培養し、LACV（感染多重度10、MOIと略す）で感染させ、EFNA2馴化培地または対照培地で感染後最大72時間維持した。 2 つの異なる EFNA2 濃度、低濃度 (2 μg/ml) または高濃度 (20 μg/ml) を使用しました。 rec-EFNA2処理により、離乳期BCECは24hpiでLACV感染レベルの低下を示し、これは高濃度のEFNA2にとって有意であった(図4a)。 成人BCECはすでにLACV感染に対してほとんど耐性があり、部分的ではあるが有意ではない感染の減少を示しました。 したがって、外因的に添加されたEFNA2は、離乳期のBCECにおけるin vitro LACV複製を制限することができます（図4a）。

a 24 および 72 hpi での離乳期および成体 BCEC における LACV 感染レベルに対する組換え EFNA2 (2 ug/ml ～ 20 ug/ml) の影響 (N = 4 ～ 12 の個々のサンプル、データは各サンプルの 25 枚の画像に基づいて収集、P)離乳期の BCEC では、コントロールと比較して、2 ug/ml および 20 ug/ml で 0.1654 および 0.0475、成体 BCEC では、コントロールと比較して、2 ug/ml および 20 ug/ml で P = 0.1068 および 0.0846）。 b 成体Efna2-/- (m)、Efna2+/- (m)およびWTマウスを105 PFU LACV (IP)に感染させ、神経系マウスの割合を示す。 補足を参照してください。 Efna2-/- (m) および Efna2+/- (m) マウスの混合 Efna3/5 遺伝子型に関する表 3 (N = 22 WT または Efna2+/- (m) マウスおよび N = 18 Efna2-/- (m) マウス、 P = 0.0105)。 c 8〜22 dpiの感染マウスの脳内のLACV RNAレベル（NC：非臨床マウスおよびC：臨床マウス、N = 18 WTまたはEfna2+/-（m）NCマウス、N = 2 WTまたはEfna2+/-（m） ) C マウス、N = 10 Efna2-/- (m) NC マウスおよび N = 8 Efna2-/- (m) C マウス)。 ここで、WT/ Efna2+/- (m) NC コントロールと比較して、WT/ Efna2+/- (m) C と Efna2-/- (m) C の両方で P = 0.0008 です。 d LACV感染Efna2-/-（m）およびWTマウスの脳における3 dpiでのウイルスRNAの測定によって評価した血管漏出（分析した各条件に関してN = 8マウスの脳）。 e LACV感染WTおよびEfna2-/-（m）マウスの脳スライスにおける血管漏出を3 dpiで検出するためのイメージング（矢印、FluoSphereビーズ：赤、Hoechst：青）。 太い矢印は、WT マウスにおける CNS 末梢における FluoSphere ビーズの局在を表し、一方、細い矢印は、Efna2-/- (m) マウスの脳実質への FluoSphere ビーズの漏出を表します (4 匹中 1 匹のマウスが漏出を示し、これをここに示します)。 (a、一元配置分散分析とそれに続く事後ダネット検定、b、マンテル-コックス ログ ランク検定、および c、d 複数の対応のない両側 t 検定、*P < 0.05、**P < 0.01、および *** P < 0.001)。スケール バー = 100 um。

Efna2がインビボでCNSのLACV感染を制限する役割を果たしているかどうかを調べるために、我々はEfnaファミリーメンバーを欠損した通常は抵抗性の成体マウスにおける神経疾患の発症を分析した。 補足表3に詳述されているように、最初に、Efna2、Efna3、およびEfna5の混合欠損遺伝子型（Efna2-/-混合、Efna2-/-（m）と略記）を持つ生後6週以上のマウスをテストしました。すべてのマウスは2つのグループに分けられました。 : Efna3 および Efna5 について +/+、+/-、または -/- の遺伝子型が混合した Efna2 欠損症のホモ接合性 (Efna2-/- (m)、または +/+、+/-、または -/- の遺伝子型が混合した Efna2 欠損症のヘテロ接合性) Efna3 および Efna5 (Efna2+/- (m)) ならびに Efna2+/+3+/+5+/+ 遺伝子型を持つ野生型マウス (野生型、WT と略す) について 105 PFU/マウスの接種後、約 50% Efna2-/- (m) マウスは、Efna3 または Efna5 遺伝子型に関係なく神経疾患を発症しました (補足表 3)。対照的に、WT または Efna2+/- (m) マウスの大部分 (~91%) は兆候を示さなかったまた、臨床的（C）神経学的疾患を有するEfna2-/-（m）マウスと非臨床的（NC）マウスとでは、高レベルのウイルスが観察されました（図4c）。インビボでのLACVの発症において阻害的な役割を果たしているようです（図2）。 4b、c)。

Efna2欠損がBBB透過性およびLACV神経浸潤に影響を与えるかどうかを判断するために、臨床症状の発現の4日前、3 dpiでマウスを検査しました。 LACV RNAは、Efna2 -/- (m)マウスの約1/2で検出されましたが、WTおよびEfna2+/- (m)グループからは1匹のみで検出されました(図4d)。 これらの LACV 感染 Efna2-/- (m) マウスには、血管漏出をモニターするために、約 100 nm の赤色 FluoSphere ビーズ (ウイルスサイズの粒子; 赤色染色) を 3 dpi で注射しました。 蛍光球は主に、WT マウスの CNS 血管内で検出されました (太い白い矢印)。 しかし、4匹のEfna2-/-マウスのうちの1匹では、脳実質内に蛍光球が検出され(細い白い矢印、図4e)、初期の血管漏出を示唆している。 したがって、Efna2-/- (m) マウスにおける疾患の 25 ～ 50% の増加は、これらのマウスのサブセットにおける CNS における早期ウイルス RNA 検出および血管漏出の検出の発生率の増加と相関していました。 これらのデータは、Efna2 が成体マウスにおいて LACV 神経浸潤を防ぐ重要な制限因子である可能性があることを示しています。

Efna2自体がウイルス制限の主要なメディエーターであるかどうかを明らかにするために、成体（> 6週齢）WTとEfna2-/-3+/+5+/+マウス（Efna2単一ノックアウト（KO）;と略記）のLACV感受性を比較しました。 Efna2-/-(s))。 予想通り、成体 WT マウスは 105 PFU/マウス LACV 用量の影響を受けませんでした (約 96% が非神経系)。 対照的に、成体Efna2-/-(s)マウスの約38%が、LACV感染に反応して神経疾患を発症した(図5a)。 さらに、Efna2-/-(s)マウスから単離された微小血管断片は、24および48 hpiでWTと比較してLACV感染レベルが高く（図5b、d）、72および96 hpiで生存率が低下しました（図5c）。 我々はまた、5 dpiのわずかに遅い時点を使用して、WTおよびEfna2-/-(s)マウスのフルオロスフィアを使用してインビボでの血管漏出を調べた。 WT成体マウスは血管漏出を示さなかったが、Efna2-/-（s）マウスは脳実質内で1〜3個の蛍光ビーズ焦点を一貫して検出した（図5e、7匹のマウスのうち5匹）。 したがって、Efna2-/-(s)マウスはLACV誘発性神経疾患に対してより感受性が高く、これは疾患発症前のCNSにおける血管漏出の増加と相関していた。 これは、WT BCECと比較したEfna2-/- (s) BCECにおけるウイルス感染の増加および細胞生存の減少とも相関していた(図5b、c)。 まとめると、これらのデータは、LACV 感染中の BBB の完全性における Efna2 の重要な役割を示しています。

a成体WTマウスとEfna2-/-マウスにおけるLACV誘発性(105PFU/マウス用量(IP))の神経疾患の比較。 (* P < 0.05、****P < 0.0001、マンテル-コックス ログ ランク検定、N = 28 匹の WT マウスおよび N = 43 匹の Efna2-/- マウス、P = 0.0013)。 b WTおよびEfna2-/-原発性BCECに対する24および48 hpiでのLACV感染（10 MOI）後のBCECの感染の比較（WTおよびEfna2-/- BCECについてはN = 33およびN = 18、平均±SDを示します、P 24 hpi および 48 hpi ではそれぞれ < 0.0001 および P = 0.0041)。 c WTおよびEfna2-/-初代BCECに対する72および96 hpiでのLACV感染（10 MOI）後のBCECの細胞生存率の比較（検証された核数）（WTおよびEfna2-/- BCECの場合はN = 24およびN = 12-18） 、平均±SDが示されており、72および96 hpiについてそれぞれP < 0.0001およびP = 0.0304）。 すべての個々のデータポイントが表示され、統計的有意性は複数の両側対応のない t 検定 (*P < 0.05、**P < 0.01、****P < 0.0001) によって分析されます。 d WTとEfna2-/- BCECを比較した24および48 hpiの代表的な画像（Hoechst：青およびLACV：緑）。 スケール バー = 100 um (画像はサンプルあたり 25 個の個別の画像を表しています)。 e 1つの代表的なWT脳切片（血管漏出なし）を、血管漏出を示す5つのEfna2-/-脳切片とともに示します（Hoechst：青、FluoSphereビーズ：赤、スケールバー= 100μm）（N = 5 WT脳およびN = 7 つの Efna2-/- 脳、そのうち 5 つの脳は血管漏出の可能性のある病巣を示した)。 対応のない t 検定を使用して病巣/脳の数を比較しました (P = 0.0195)。

Gja1 (Cx43 タンパク質を発現する) のノックダウンは in vitro での LACV 感染に影響を与えたため、我々は Cx43 を活性化または上方制御することでウイルス感染と病因が軽減される可能性があると仮説を立てました。 4-フェニル酪酸 (4-PBA) は、Cx43 を含むいくつかのコネキシンの活性化剤およびチャネル形成エンハンサーとして知られています。 我々は、bEnd.3細胞をLACV +/- 4-PBAで感染させ、異なる時点でLACVおよびCx43について免疫染色した。 4-PBA処理により、LACV感染が大幅に減少し、96 hpiでの宿主細胞の生存が増加しました（図6a）。 共焦点顕微鏡を使用して、96 hpi での LACV 感染の減少 (LACV: 緑色) が Cx43 涙点形成の増強 (Cx43: 赤) と相関していることを観察しました。 Cx43 点形成の増加（白い矢印；顆粒状または層状の Cx43 染色で示される）または細胞表面への局在化は 4-PBA の用量依存性でした（図 6b）25。以前の研究で観察されたように 25、Cx43 タンパク質レベルの上方制御はウェスタンブロットによって確認されました（図6c）。 したがって、Cx43タンパク質レベルまたは涙点形成における4-PBA誘導性の上方制御は、インビトロでのLACV感染の阻害と相関していた。

a、b LACV 感染 (10 MOI) bEnd.3 細胞を 4-PBA (0 ～ 10 mM) で異なる hpi で処理し、画像化して (a) ウイルス強度またはウイルス誘発性の細胞枯渇を測定しました (N = 4)サンプル、各サンプルから得られた 25 枚の画像に基づいて収集されたデータと SD による平均値が表示されます）または (b) Cx43 (赤)、LACV (緑)、および Hoechst (青) の局在化 (各条件で得られた約 12 ～ 25 枚の画像の代表) 、ＰＢＡ ０ｍＭと比較して、ＰＢＡ２．５、５および１０ｍＭからのＰ＝０．１１４２、＜０．０００１および０．００９７）。 白い矢印は、Cx43 の点状染色を表します。 c 4-PBA処理bEnd.3細胞におけるCx43タンパク質レベルのウェスタンブロットおよび濃度測定分析。 Gapdh は、定量のためのローディング コントロールおよび正規化係数です (N = 3 の各条件と平均 SD が示されています。PBA 2.5、5、および 10 mM では P = 0.7647、0.0043、および 0.4589 であり、PBA 0 mM と比較されています)。 d 2000 PFUのLACVに感染した離乳期マウスを、5 dpiまでビヒクル（LV）または500 mg/kg-日の4-PBA（LP）で処理し、神経学的エンドポイントを評価しました（各条件についてN = 9マウス、P = 0.0074）。 e 3 dpiでのマウス脳におけるLACVとGja1発現の間の相関に対する4-PBA処理の効果（マウスから得られたN = 9 LVおよびN = 11 LP脳RNAサンプル、LACVとGja1の比較についてはP = 0.0311および0.0147）。 f 4 dpi でのマウス脳スライスの共焦点イメージングによって評価した、LACV の侵入および局在に対する 4-PBA の効果 (赤: ZO1、緑: LACV、青: Hoechst/核)。 (a) 二元配置 ANOVA に続いてダネット検定を行い、すべてのグループを同時に溶媒と比較しました。 (b) 一元配置 ANOVA に続いてダネット検定を行い、個々の点は個別のイメージング フィールドを表します。(c) 複数の両側検定対応のない t 検定、d マンテル-コックス ログ ランク検定、e、対応のない両側 t 検定、ここで *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001、および N = 実験ごとに 3 ～ 4。 スケール バー = 100 um (白、通常の画像の場合)、スケール バー = 10 um (黄色、ズームイン画像の場合)。

4-PBA が LACV 誘発性神経疾患を抑制できるかどうかを調べるために、LACV に感染した離乳期マウス（生後約 21 ～ 23 日）を毎日 500 mg/kg の 4-PBA で 0 ～ 5 dpi 投与しました（IP 注射、LP）。 LACV 感染マウスとビヒクル処理マウス (LV) を並行して分析しました。 LV マウスは 6 ～ 8 dpi の間で神経疾患を示しました。 対照的に、LP マウスは神経疾患の発症が遅れました (図 6d)。 神経学的エンドポイントでは、ウイルスレベルとGja1 mRNA発現レベルは、ビヒクル処理グループと4-PBA処理グループで同様でした（補足図5）。 しかし、ウイルスが最初にCNSに侵入する3 dpiでの以前の分析では、LP動物のウイルスレベルが低下し、これがGja1 mRNA発現の増加と相関していることが実証されました（図6e）。 4 dpi で、LV および LP マウスから脳を分離し、内皮マーカー ZO1 および LACV について共染色しました。 LV マウスは、脳の OB および OT 領域に持続的かつ顕著な LACV 染色の存在を示しました (図 6f; 上のパネル)。 対照的に、4-PBA処理マウスは、ビヒクル対照と比較して、検出可能なLACVがないか（マウス4匹中3匹）、またはウイルス染色がはるかに限定されていた（マウス4匹中1匹、（図6f;下のパネル））。 より高い倍率の画像は、LVマウスの高度に血管化された領域の脳実質における顕著なLACV感染を示しましたが、LPマウスではLACV感染は主に4 dpiの血管内腔に限定されていました（図6f、右側のパネル）。 特に、ウイルス粒子は、4 dpi で脳実質内に十分な漏出を確立することなく血管内に制限されました。 したがって、4-PBA 治療は Cx43 の上方制御を誘導し、LACV 感染の初期段階での OB/OT 領域でのウイルス感染と播種を部分的に制限する可能性があります。

LACV 感染に対する年齢に関連した感受性は、血管漏出を誘発し、CNS にアクセスできる LACV の能力に部分的に依存します16。 この研究では、系統的な「スクリーニングからターゲティング」アプローチを採用し、LACV感受性の違いに寄与する可能性のある、離乳期と成体の微小血管断片（ex vivo）/BCEC（in vitro）間の遺伝子発現の違いを明らかにしました。 トランスクリプトーム解析により、遺伝子が年齢特異的、免疫関連、または脳の位置特異的ないくつかのグループに分類できることが実証されました。 次に、標的 siRNA ライブラリを使用して、ウイルス感染とそれに伴う細胞死の制御におけるこれらの因子の役割を調査しました。 追跡調査、検証研究、および機構分析から、成人におけるLACV誘発性血管漏出の制御に重要である可能性があり、小児におけるLACV耐性を高めるための治療標的となる可能性のある、主に制限因子であるいくつかの遺伝子を発見した。

このBCEC漏出モデルにおける予測可能な経路は、TJタンパク質の変化であると思われる。 C 型肝炎ウイルスやデング熱ウイルスなどのいくつかのウイルスは TJ を利用して細胞に侵入します 26 が、LACV 侵入因子はほとんど知られていません 21,27。 我々の一次スクリーニングでは、TJ Cldn2 および Cldn5 のノックダウンにより LACV 感染が減少しましたが、Cldn1 のノックダウンでは有意な効果は示されませんでした。 ただし、これらの遺伝子の影響は、完全なストレスのない単層培養で研究されました。 生体内ではBCECの立体構造が血管内で非常に重要であるため、TJの混乱が感受性細胞へのLACV侵入に寄与している可能性がある。 これに関連して、我々は、GJ 発現の変化が LACV 感染と BCEC への損傷を制御する重要な要素である可能性があることを観察しました。 我々は、Gja1 mRNA28によって発現される主要な脳内皮GJタンパク質の1つであるCx43が、bEnd.3細胞におけるLACV感染の制御に役立つことを特に観察した。

RNA-seq、標的siRNAスクリーニング、およびその他のフォローアップ分析から、Bst1、Clec4e、Efna2、H2q6、Ifitm3およびLy6c2を含む、細胞結合の維持に直接関与しないいくつかの遺伝子を研究しました。 Bst1 は再生特性 29 を持ち、離乳期の BCEC に蔓延している内皮幹細胞のマーカーですが、この遺伝子には主要な調節機能はありませんでした。 Clec4e、H2q6、Ifitm3 などのよく特徴付けられた免疫調節因子は、LACV またはその他のウイルス感染において明確な役割を果たしています。 私たちの研究では、Clec4e は LACV21 に対する抗ウイルス応答を誘導し、ウイルス感染とプラーク生成を（部分的に）制限しました 30。MHC クラス I の一部である H2q6 は、抗原提示において重要な機能を持ち 30、特に内皮細胞においては、アクチン細胞骨格ネットワークを調節し、細胞生存31,32。 LACV 感染は、培養 BCEC で観察される細胞変性効果と関連している可能性のあるアクチンネットワークのリモデリング 16 を引き起こす可能性があります 17。 興味深いことに、H2q6 のノックダウンにより、F-アクチンの断片化に関連したより高度なウイルス感染と合胞体様の凝集形成が生じました。 Ifitm3 は、侵入 33 または pH 依存性の融合 34 をブロックする既知のウイルス制限因子です。 したがって、Ifitm3 のノックダウンは、より多くの感染細胞を含む BCEC でより高い LACV 感染強度を誘導しました。 内皮 Ly6c2 はウイルス感染においてこれまでに報告された役割を持っていませんが、Ly6c2 ノックダウンによるウイルスの付着/侵入、感染、複製、および LACV の播種の増強が観察されました。 我々は推定上の制限因子に重点を置いて追跡解析を行ったが、Mmp-25は離乳期のBCECを強化した推定上の感受性因子の1つであり、そのノックダウンにより原発性BCECにおけるウイルス感染が減少したため、さらなる解析が必要になる可能性がある。 まとめると、これらの観察は、BCEC の年齢特異的な LACV 感受性が、成人の宿主耐性を促進する因子の複雑な多遺伝子ネットワークによって制御されていることを示唆しています。

これらの因子の中で、成体で強化された Efna2 は、bEnd.3 細胞および初代 BCEC におけるウイルス感染の制御およびウイルスプラーク生成において独特の表現型を示しました。 Efna2 はエフリン (Efn) ファミリーに属するシグナル伝達分子であり、同族の Eph 受容体相互作用を通じて血管新生と内皮細胞の維持に関与します。 Efna2 は、ニューロンの発生、分化、遊走 35,36,37 から血管新生や癌転移 23 までの役割を持つことが最近確立されました。 私たちの研究では、rec-EFNA2によるBCECの直接治療により、in vitroでウイルス感染が減少することが観察されました。 Efna3/5混合欠損症を有するEfna2-/-(m)成体マウスのLACV感受性増加の最初の観察は、EphrinA分子がLACV誘発性神経疾患に対する抵抗性において役割を果たしている可能性を示唆した。 これは、Efna2-/-(s)単一KOマウスで観察された感受性によってさらに確認され、Efna2遺伝子が成体マウスにおけるLACV耐性の重要な因子であることを示唆している。 同様に、Efna2-/-(s)マウスから単離されたBCECは、インビトロLACV感染および感染誘発細胞死に対してより感受性が高かった。 また、かなりの数のLACV感染Efna2-/-(s)マウスがCNS実質へのウイルスサイズの粒子の漏出を示した。 これは、ウイルス耐性の付与における Efna2 の重要な役割を示唆しています。 Efna2 を治療目的で in vivo で標的にできるかどうかは、今後の研究における重要なテーマとなるでしょう。

前述のように、CJ タンパク質は BBB を介したウイルス侵入を制御するための主要な標的であり、我々は Gja1 遺伝子産物 Cx43 を別の潜在的な制限因子として同定しました。 これまでの研究では、ラウス肉腫ウイルス 38 、HIV39 やマウス肝炎ウイルス感染 40,41 などのウイルスが、さまざまな細胞型で Cx43 の発現と機能を調節できることが示されています。 古典的豚コレラウイルス感染も内皮細胞のCx43を枯渇させました42が、Cx43の役割とその増強がブニヤウイルス感染を制限できるかどうかについてはこれまで研究されていませんでした。 感受性の高い離乳期の動物におけるウイルス漏出を減らすことを目的として、我々は、Cx4343 のよく特徴付けられている既知の小分子活性化因子である 4-PBA を利用しました。 4-PBA は、Cx4346 の生合成と輸送を制御する 29 kDa の管腔小胞体 (ER) タンパク質 (ERp29)44,45 を上方制御します。 ERp29 などのシャペロンの活性化が 4-PBA による BCEC における LACV の減少の根本的なメカニズムであるかどうかはまだ判明していませんが、この戦略は LACV 誘発性脳炎と闘うための有望なアプローチとなります。 ウイルス曝露開始時の4-PBA投与がウイルス侵入と神経症状を軽減するのに十分であったことは注目に値し、このことはこの潜在的な治療法に対する特に迅速な反応を示している可能性がある。

要約すると、本発明者らは、体系的なトランスクリプトームおよび遺伝子摂動スクリーニングアプローチを利用して、BCECのLACV感受性および感染誘発性血管漏出の制御に関与する遺伝子または遺伝子産物を同定した。 我々は、EFNA2とCx43が、LACV感染に対する成人特異的抵抗性を支持する2つの重要な因子であることを特定した。 LACV 神経浸潤の制御に関与する 2 つの異なる分子制御因子の同定は、LACV などのウイルスが CNS にアクセスして神経浸潤性疾患を引き起こす能力に影響を与える、未熟 BBB と成熟 BBB の間の差異を制御する複数のエフェクター間の相乗作用を示唆しています。

すべての動物実験は、実験動物管理原則を遵守し、NIH/NIAID/RML 施設内動物管理使用委員会の承認に従って、動物プロトコル RML-2018-018-E、LISB 3E、および LISB 4E に基づいて実施されました。 この研究ではヒトのサンプルは使用されませんでした。 動物ケージ内と動物保管室の両方の温度範囲は 20 ～ 24 °C、湿度範囲は 30 ～ 70% でした。 12 時間の明暗サイクル (午前 6 時～午後 6 時) を常に維持しました。 実験後、すべてのマウスを安楽死させた。

離乳期（～３週齢）および成体（＞６週齢）マウスを、０．５ｍｇ／ｍＬのＬｙｏＶｅｃトランスフェクション試薬溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で希釈した１００μｇのＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ（ＨＭＷ）で、１００μｌの眼窩後（ＩＶ）経由で処置した。 ） 注射。 LyoVec 試薬は、メーカーの推奨に従って付属の脱イオン滅菌水を使用して再構成され、ビヒクル対照として単独で使用されました。 注射後３時間で、微小血管断片を処置動物およびビヒクル動物から除去した。 LACVおよび模擬感染条件からのOB対CT微小血管フラグメント転写発現の比較のため、C57BL/6離乳マウスを、200μlの滅菌医薬品グレードPBSに希釈した2000PFU IP用量のLACVで感染させた。 モックマウスには、PBSで希釈した等量の未感染Vero上清を与えました。 OB および CT からの微小血管フラグメントを LACV および模擬感染マウスから 3 dpi で単離しました。 以下に記載するように微小血管断片からRNAを抽出し、Agencourt RNAClean XPビーズ（Beckman Coulter、Brea、CA）を使用して精製した。 ＲＮＡ濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ蛍光ＲＮＡ定量法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して測定した。 RNA の純度と完全性は、Nanodrop 8000 UV 分光光度法 (Thermo Fischer Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム) と Bioanalyzer RNA 6000 Pico チップ アッセイ (Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ) をそれぞれ使用して評価しました。 メーカーの推奨プロトコール (Illumina, Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ) に従って、TruSeq Stranded mRNA サンプル調製キットを使用して、115 ng (成体/離乳期) または 170 ng (OB/CT) RNA からシーケンシング ライブラリーを生成しました。 最終的な精製TruSeqライブラリーをイルミナシーケンシング用のKapa SYBR FASTユニバーサルqPCRキット(Kapa Biosystems、ウィルミントン、マサチューセッツ州)を使用して定量し、2nMに希釈し、等しくプールしました。 ライブラリーは、TruSeq Rapid PE Cluster キットおよび Rapid 200 サイクル SBS キット (Illumina, Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、HiSeq 2500 機器で配列決定されました。

CutAdapt47 を使用して生の fastq ファイルからアダプター配列を削除し、FAASTX ツールキット 0.0.14 (Hannon Lab、CSHL、RRID:SCR_005534) を使用して品質フィルター処理およびトリミングを行いました。 高品質のフィルター処理およびトリミングされたリードは、Hisat2 バージョン 2.1.0 を –no-unal –no-mixed パラメーター設定で使用して、マウス参照配列 GRCm38 にマッピングされました48。 アライメント ファイルは、GRCm38 参照アノテーション ファイルを使用して遺伝子の数を生成するために、HTSeq バージョン 0.9.1 Python ライブラリ 49 の HTSeq-count への入力として使用されました。 生のカウント行列は、DESeq250 を使用した差次的発現分析の入力として使用されました。 遺伝子は、DESeq の縮小対数倍変化 (lfc) および調整された p 値によってランク付けされました。 取得したデータは、統計的有意性、塩基平均 (標的遺伝子の読み取り数)、log2 倍数変化を使用してフィルタリングされ、R (バージョン 3.6.0)、Ingenuity Pathway Analysis (IPA、バージョン 84978992、Qiagen)、および SIGNAL (バージョン) に供給されました。 2.0) 脳微小血管に対する年齢依存性の免疫刺激効果に関与する経路と遺伝子を理解するためのソフトウェア51。 異なるグループを比較することにより、LACV 感染におけるさらなる分析のために約 50 個の遺伝子が選択されました。

すべての動物実験は、実験動物管理原則を遵守し、NIH/NIAID/RML または NIH/NIAID/Bethesda Institutional Animal の承認に従って、動物プロトコル RML-2018-018-E、LISB 4E および LISB 3E に基づいて実施されました。ケアと使用委員会。 C57BL/6 (Jackson Laboratories から入手) または Efna2-/- (m) または Efna2-/-(s) マウスを、RML または Bethesda Campus の繁殖コロニーで維持しました。 Richard Bennett 博士から贈られた LACV ヒト 1978 ストックをマウスの LACV 病因の研究に使用し、接種用に 200 µl の医薬品グレードの滅菌 PBS で適切な用量に希釈しました。 離乳期の子（生後約 3 週齢）には 2000 PFU/マウスの低用量を IP 接種し、成体（生後 6 週齢以上）には 105 PFU を IP 接種しました。 模擬接種マウスに、ウイルス希釈の体積に一致するように、未感染ベロ細胞からの細胞上清を適切な量含む２００μｌのＰＢＳを接種した。 全脳またはOB-CT領域を、LACVおよび模擬接種マウスから3 dpiで別々に単離した。 補足表 4 は、この原稿全体で使用される実験グループおよびその他の命名法のほとんどの略語を表しています。

脳微小血管は、前述のように単離および増殖されました 17。 簡単に説明すると、滅菌 PBS による経心臓灌流後、離乳マウスおよび成体マウスから全脳を単離し、その後小片に切り刻みました。 次に、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM; Sigma）中の10 mg/mlのコラゲナーゼ（CLS2; Worthington Biochemical）を使用して、37℃のインキュベーターシェーカー内で脳片に対して1時間の消化を実行しました。 DMEM中で調製した20%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液の存在下、1000gで20分間遠心分離することにより、消化された組織を細胞残骸および白質脂質から分離した。 ＤＭＥＭ中の１０ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ／ディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）の溶液を、得られたペレットに添加し、３７℃で４５分から１時間インキュベートした。 このステップから得られた微小血管フラグメントを、1000 gで10分間遠心分離した33%連続Percoll勾配で分離しました。 最後に、微小血管フラグメントを収集し、エクスビボおよびインビトロ実験に使用する前にDME​​Mで2回洗浄しました。 OB と CT の比較では、先端の細い鉗子を使用してこれらの特定の領域を単離し、上記と同じプロトコルに従ってこれらの異なる脳領域から微小血管断片を単離しました。

微小血管断片を、IV型コラーゲン(Sigma)およびヒトフィブロネクチン(Sigma)でコーティングされたチャンバー付きスライドまたはマルチウェルプレート上にプレーティングした。 20％ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％グルタミン、1ng/mlの線維芽細胞成長因子-2（R&D Systems）および4μg/mlのピューロマイシン（Sigma）を添加したDMEMを、インキュベートされた初代BCECの培養に使用しました。加湿した 5% CO2、95% 空気雰囲気、37 °C で。 マウス内皮細胞株 bEnd.3 (ATCC、CRL-2299) も、10% ウシ胎児血清、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、および 1% グルタミンを添加した DMEM を使用して同様に培養しました。 インビトロ実験では、コンフルエントな単層に異なる MOI の LACV (標準化のため) を接種し、MOI 10 を実験に使用しました。 1.5時間後、新鮮な培地を上に加え、所望の時点で細胞を分析した。 模擬接種サンプルを並行して維持した。

Zymo Research の RNA 単離キットを使用し、メーカーのプロトコルに従って、ex vivo で単離された微小血管フラグメントまたは培養 BCEC から全 RNA を単離しました。 全RNAをDNase I (Invitrogen)で37℃で30分間処理し、RNAクリーンアップカラム(Zymo Research)で精製しました。 cDNAは、製造業者の指示に従ってiScript逆転写キット(Bio-Rad Laboratories)を使用して、クリーンアップしたRNAサンプルから調製しました。 cDNAサンプルをRNaseフリー水で5倍に希釈し、それらの希釈サンプルをSYBR Green SuperMix with ROX (Bio-Rad Laboratories)を使用したqPCRによる遺伝子発現分析に使用しました。 すべての分析において、Gapdh をハウスキーピング遺伝子コントロールとして使用しました。 この研究で使用したプライマー配列を補足表 5 に示します。

外科的に除去したマウスの脳は、Rneasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen) に含まれる溶解バッファーで解凍するまで、-80 °C で保存されました。 TissueRuptor (Qiagen)を使用して脳をホモジナイズし、メーカーのプロトコールおよび同じキットを使用してRNA抽出を行った。 NanoDrop 1000 分光光度計 (Thermo Scientific) を使用して濃度を測定し、iScript cDNA 合成キット (Bio-Rad Laboratories) を使用して cDNA を合成しました。 LACV RNA の測定には SYBR Green Assay システム (Applied Biosystems) を、製造元のプロトコールを使用して Gja1 を検出するには TaqMan Real-Time PCR Assays (Thermo Scientific) を使用したリアルタイム PCR に同量の cDNA を使用しました。 適切なハウスキーピング遺伝子コントロールを取得し、QuantStudio 6 Flex (Applied Biosysterms) マシンまたは Applied Biosystems ViiA 7 システムを使用して CT 値を測定しました。 QuantStudio Real-Time PCR ソフトウェアを使用してデータを抽出しました。

bEnd.3 細胞タンパク質は、プロテアーゼ阻害剤カクテル (cOmplete Tablets、Mini、EDTA フリー、Roche) およびホスファターゼ阻害剤カクテル (PhosSTOP EASY) を含む RIPA バッファー (Thermo Scientific) を使用して、96 hpi (LACV 接種量の 10 MOI) で抽出されました。 Pack、Roche）およびタンパク質濃度をBCAアッセイキット（Thermo Scientific）を使用して測定した。 免疫ブロッティングは、Cx43 (1:500、ポリクローナル血清、Sigma) を使用して行い、Gapdh (1:1000、AbCam) を正規化対照として使用しました。 ウェスタンブロットのトリミングおよび未処理のスキャンは補足図6に含まれています。

初代BCECおよびbEnd.3細胞をコンフルエントな単層まで増殖させ、メーカーのプロトコールに従ってsiRNAトランスフェクションを実施しました。 ＴｒａｎｓＩＴ－ＴＫＯトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ．）を、最終濃度５０ｎＭのｓｉＲＮＡとともに、ほとんどの実験（９６ウェルプレートの２μｌ／ウェル）に使用した。 ウェルあたり 100 ～ 200 μl の総反応量を使用し、37 °C のインキュベーター (加湿 5% CO2、95% 空気雰囲気) 内でインキュベートしました。 トランスフェクションから約 72 時間後、細胞のトランスフェクション効率を視覚的にチェックし (si-Lethal と si-NT を比較することにより)、さらなる実験を続けました。 コントロール siRNA を除き、各遺伝子に対して 2 つの独立した siRNA 配列をそれぞれ 3 つの複製で利用しました。 この研究で使用した siRNA は補足表 5 に記載されています。

WTまたはEfna2-/-(m)マウスに、105PFU/マウス用量のLACV(IP)を接種した。 3 dpi で、これらのマウスに 100 nm FluoSpheres カルボン酸修飾マイクロスフェアビーズ (Thermo Scientific) を眼窩後 (静脈内; IV) 注射しました。 マウスは 30 分後に安楽死させた。 麻酔とそれに続く経心臓灌流による。 マウスの脳を採取し、凍結切片用に同様に処理しました。 PBSを使用してスライドを再水和した後、凍結切片をHoechstで対比染色した。 取り付け後、Leica DMI 6000B 落射蛍光顕微鏡と LAS-X ソフトウェアを使用して画像をキャプチャしました。

4-PBA (Sigma) および rec-EFNA2 (Sino Biological) を細胞処理のために通常の培地に溶解しました。 最高濃度の 4-PBA (10 mM) で粒子状物質が観察された場合は、ジメチルスルホキシド (DMSO; (< 0.5%)) を使用しました。 以前の報告書 52 の推奨に従い、最大用量 500 mg/kg-day を使用し、薬物毒性による動物の死亡を避けるために注意を払いました。 離乳期のマウス（～10g）に、コーン油（10mlあたり200～300μlのDMSOを含む）に溶解した4-PBA（500mg/Kg-日）を注射し、毎日～200μlのIP注射を行った。 マウスの体重を毎日測定し、それに応じて注射量を調整しました。 ビヒクルマウスにも同様に、4-PBAの非存在下でDMSOを補充したコーン油溶液を注射した。

Efna2-/- (m) または Efna2-/- (s) マウスは、David Feldheim 教授 (カリフォルニア大学サンタクルーズ校) のご厚意により寄贈されました。 マウスを近交系にし、以下の方法を使用して遺伝子型をチェックしました。エフリン A2 プライマーは A2-1: 5'-CCG CTT CCT CGT GCT TTA CGG TAT C -3'、A2-2: 5'-GGG CCG GTT GCA TTC CCA GCG-3' および A2-3: 5'-GTG AGC GCT GTG GGT GAT GGC GGC-3' (WT は A2-2 および A2-3 によって検出されます): 200 bp および Efna2 変異体は A2-1 および A2-1 によって検出されますA2-2: 500 bp。 エフリン A3 プライマーは、A3-1: 5'-GGC TTT TTC TAC AAT CTT TTC TCA – 3'、A3-2: 5'-TCA TGT AGG AGA TAC AGG GC – 3' および A3-3: 5'-ACC AAA GAA CGG AGC CGG TTG GCG – 3' ここで、WT は A3-1 および A3-2: 500 bp によって検出され、Efna3 変異体は A3-2 および A3-3: 200 bp です。 エフリン A5 プライマーは、A5-1: 5'-AGC CCA GAA AGC GAA GGA GCA AAG C –3'、A5-2: 5'-ATT CCA GAG GGG TGA CTA CCA CAT T –3' および A5-3: 5' です。 -TCC AGC TGT GCA GTT CTC CAA AAC A –3' ここで、WT は野生型 A5-2 および A5-3 によって検出されます: 400 bp、変異体は A5-1 および A5-3 によって検出されます: 500 bp。 これらすべてのプライマーの詳細は、Efna2、Efna3、および Efna5 の自動ジェノタイピング アッセイを開発するために Transnetyx と共有され、そこから遺伝子型が取得されました。

免疫蛍光研究は、以前に記載されたプロトコールに従って行われました17。 標準的な免疫蛍光の場合、初代BCECまたはbEnd.3細胞をマルチウェルプレートまたはチャンバー付きガラススライド上にプレーティングしました。 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を含む PBS を使用してサンプルを固定し、続いて 0.5% Triton X-100 を含む PBS で細胞を透過処理しました。 次いで、５％の熱不活化ロバ血清および０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳで細胞をブロックした。 一次抗血清（ブロッキング溶液で希釈）と 1 時間（RT）または一晩（4 °C）インキュベートした後、非特異的に結合した抗体をブロッキング血清で洗い流しました。 最後に、サンプルをブロッキング溶液で希釈した二次抗血清で標識し、PBSで洗浄し、ヘキスト染色で10分間インキュベートしました。 サンプルは、Fluoromount-G (Southern Biotech) を使用してマウントし、暗所で室温で乾燥させて硬化させ、長期使用のために 4 °C で保存するか、PBS とともに 4 °C 冷蔵庫で保存しました。 画像は、CX7 顕微鏡 (Thermo Scientific) または Leica DMI8000 倒立共焦点顕微鏡 (シカゴ、イリノイ州) 顕微鏡を使用して取得されました。 画像および定量データは、Cellomics ソフトウェア (Cx7 マシン)、LAS X (ライカ共焦点および落射蛍光顕微鏡用)、フィジー (1.52n).ImageJ (1.52a、NIH) または Imaris 8 (Bitplane、スイス) で取得および/または処理されました。 ) または FlowJo 10.8.1 ソフトウェア。 グラフパッド Prism 8 および 9 および Microsoft Excel (2010) を使用しました。

マウスに経心臓的に PBS を灌流し、脳を採取しました。 次に、脳を 10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) で 24 時間固定し、続いて 10% スクロース、次に 30% スクロースで脳を平衡化しました。 凍結保護後、Tissue Plus OCT コンパウンド (Fisher HealthCare) を使用して脳をマウントし、凍結し、CM1 950 クライオトーム (Leica Microsystems) を使用して 10 μm 切片を得ました。 次に、前述の方法 41 に若干の変更を加えて、LACV 抗体 (1:500 ～ 1:800) または ZO1 抗体 (1:250、Thermo Scientific) で切片を染色しました。 簡単に説明すると、凍結組織切片を氷冷した95%エタノールで洗浄し、次に室温(RT)でPBSで洗浄して、クリオマトリックスを除去した。 疎水性マーカーペンを使用して、セクションの周囲に境界を作成しました。 次いで、スライドをＰＢＳで洗浄し（３回）、ブロッキング血清（０．５％トリトンＸ－１００および５％ロバ血清を含むＰＢＳ）とともに室温でインキュベートした。 切片を、ブロッキング血清で希釈した一次抗血清とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 切片をＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング血清で希釈した二次抗血清とともに室温で２時間インキュベートした。 すべてのインキュベーションは加湿チャンバー内で行われました。 最後に、ＰＢＳで３回洗浄した後、核をヘキストで対比染色した。 画像は、Leica DMI8000 倒立共焦点顕微鏡 (シカゴ、イリノイ州) 顕微鏡を使用して取得されました。 画像は、ImageJ (1.52a、NIH)、Fiji (1.52n、NIH)、または Imaris 8 (Bitplane、スイス) ソフトウェアで処理されました。

感染した bEnd.3 培養物および模擬接種した bEnd.3 培養物からの上清を、異なる hpi で収集しました。 プラークアッセイは、以前に記載された方法 17 を使用して実行されました。 簡単に説明すると、2% FBS および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した DMEM 中のさまざまな希釈の上清を Vero 細胞単層に接種しました。 1.5% カルボキシメチルセルロース (CMC) を含む MEM を 1 時間後に添加し、加湿 5% CO2、95% 空気雰囲気中で 37 °C でインキュベートしました。 5 dpi で、10% ホルマリン溶液を使用して細胞を固定し、洗浄し、0.35% クリスタル バイオレット溶液を使用してプラークを視覚化しました。

bEnd.3細胞を特定のhpiで採取し、細胞生存率をCellTiter-Glo(Promega)試薬を使用し、製造業者のプロトコールを使用して測定した。 発光はFLUOstar Omega (BMG Labtech)を用いて測定した。 あるいは、細胞数は、Cx7 イメージャー (Thermo Scientific) を使用して核の数 (Hoechst で染色) から測定されました。

bEnd.3 細胞のコンフルエントな単層を 4 °C で事前に冷却し、細胞を氷上で 10 MOI の LACV 接種材料で感染させました。 細胞を 4 °C で 2 ～ 3 時間維持し、ウイルス粒子が細胞表面に付着するだけで、低温では複製できないようにしました。 接種材料を注意深く除去し、細胞を 4 °C で徹底的に (2 ～ 3 回) 洗浄しました。 次に、新鮮な培地を上に加え、細胞を 37 °C に加熱しました。 次いで、付着したウイルスを、上昇した温度で２４ｈｐｉまで細胞内で増幅させ、免疫蛍光アッセイを使用してＬＡＣＶ強度を分析した。

平均値 ± SD、または平均値を含む個々のデータポイントが各実験に表示されます。 RNA-seq 解析では、有意性について Wald 検定を使用した負の二項一般化モデルを実行しました。 両側 p 値は、Benjamini Hochberg 法を使用した複数の検定用に補正されました。 一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較検定または Dunnett の多重比較検定は、多重平均比較またはコントロール平均比較の事後分析として実行されます。 2 群比較またはスクリーニング分析では、複数の対応のあるまたは対応のない t 検定が実行されます。 生存比較は、ログランク (マンテル-コックス) 検定を使用して行われました。 統計分析の詳細は、個々の図の凡例に記載されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

RNA-seq データは Gene Expression Omnibus (GEO) に寄託されており、公的に入手可能です (GSE217434)。 データセットへのハイパーリンク: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=Gse217434。 SIGNAL ソフトウェアは、ハイパーリンク https://signal.niaid.nih.gov/ を使用して一般に入手できます。 野生型マウス (RRID: IMSR JAX:000664 および系統番号:000664) は、The Jackson Laboratory で入手できます。 Efna2-/- マウスは、NIAID の Iain Fraser 博士の研究室でリクエストに応じて入手できます。 現在の研究中に使用および/または分析された他のデータセットは、要求に応じて責任著者から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リュー、SH et al. 化学シャペロン 4-フェニル酪酸は、インビボおよびインビトロで小胞体ストレス媒介腎線維症から保護します。 オンコターゲット 7、22116–22127 (2016)。

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我々は、Efna2-/- (m) および Efna2-/- (s) マウスをご提供いただいた David Feldheim 教授 (カリフォルニア大学サンタクルーズ校) に感謝します。 Samuel Katz、Jing Sun、Sharat Vayttaden のそれぞれ、トランスクリプトーム スクリーニング、siRNA ターゲット スクリーニング、高スループット イメージングの親切な支援とトレーニングに感謝します。 RNA-seq および追跡分析に関して親切な支援をしていただいた NIAID Research Technologies Branch の Rocky Mountain Laboratories ゲノミクスユニットに感謝します。 RNA-seq ライブラリーの調製と配列処理については、Stacy Ricklef に特に感謝します。 また、イメージング設備を提供していただいたNIAID研究技術部門のイメージングコアにも感謝します。 私たちは、NIAID 14BS の動物管理者および施設管理者の動物の維持と繁殖への支援に感謝し、感謝します。 また、原稿を批判的に読んでくださったJames Striebel氏、Simote Foliaki氏、Sinu John氏、Clinton Bradfield氏、Julia Gross氏、RMLの持続性ウイルス疾患研究所（LPVD）およびベセスダの免疫システム生物学研究所（LISB）のメンバーに感謝します。この作業の過程で重要な意見や支援を得ることができます。 この研究は、国立衛生研究所 (NIH) の国立アレルギー感染症研究所 (NIAID) の学内研究プログラムによって支援されました。 RB は RML-Bethesda NIAID フェローシップによって支援されました。

国立衛生研究所 (NIH) によって提供されるオープンアクセス資金。

これらの著者は同様に貢献しました: Karin E. Peterson、Iain DC Fraser。

神経免疫学セクション、持続性ウイルス疾患研究所、ロッキーマウンテン研究所、NIAID、NIH、903 S. 4th Street、MT、59840、ハミルトン、米国

ラーフル・バス、クレイトン・W・ウィンクラー、カリン・E・ピーターソン

シグナル伝達システムセクション、免疫システム生物学研究所、国立アレルギー感染症研究所、国立衛生研究所、4 Memorial Drive、ベセスダ、メリーランド州、20892、米国

ラーフル・バス & イアン DC フレイザー

研究技術部門、国立アレルギー感染症研究所、国立衛生研究所、4 Memorial Drive、Bethesda、MD、20892、米国

サンダー・ガネサン

ゲノミクス研究セクション、研究技術部門、学内研究部門、国立アレルギー感染症研究所、国立衛生研究所、903 S. 4th Street、MT 59840、Hamilton、MT、USA

サラ・L・アンジック & クレイグ・マーテンス

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RB は実験を実行し、原稿を書きました。 SG は、共焦点画像の取得、処理、分析を支援しました。 CW は、RNA-seq 解析に関連するすべての実験を実行しました。 SLA と CM は、RNA-seq データの実行、分析、目録作成を行い、トランスクリプトーム スクリーニング データ分析 (IPA 分析、火山プロットの準備など) を支援しました。 KEP と IDCF はプロジェクトを設計し、実験を監督し、原稿を執筆しました。 KEP と IDCF は同等に貢献しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

カリン・E・ピーターソンまたはイアン・DC・フレイザーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

著者全員がこの原稿の投稿を承認しました。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Andrew MacLean と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Basu、R.、Ganesan、S.、Winkler、CW 他。 ラクロスウイルスの神経侵入と病因の年齢特異的遺伝子調節因子の同定。 Nat Commun 14、2836 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37833-x

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受信日: 2022 年 8 月 7 日

受理日: 2023 年 4 月 3 日

公開日: 2023 年 5 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37833-x

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